里氏木霉內(nèi)切纖維素酶活性架構(gòu)及關(guān)鍵亞位點(diǎn)功能研究.pdf

1、木質(zhì)纖維素是自然界分布廣泛的可再生資源，其高效轉(zhuǎn)化利用對(duì)于我國(guó)的可持續(xù)發(fā)展和農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化具有重要的戰(zhàn)略意義。纖維素是木質(zhì)纖維素的主要成分，普遍存在于植物細(xì)胞壁中，每年植物經(jīng)光合作用產(chǎn)生的纖維素總量高達(dá)1011噸，是自然界最豐富的多糖物質(zhì)。纖維素酶是纖維素降解過(guò)程發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶組分，根據(jù)序列一致性被分為不同的糖苷水解酶家族，不同家族中的纖維素酶采取不同的空間架構(gòu)和催化機(jī)制?；诮Y(jié)構(gòu)生物信息學(xué)平臺(tái)，統(tǒng)計(jì)分析不同糖苷水解酶家族纖維素酶的序列、

2、空間結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵氨基酸，有助于我們更加深入的了解不同家族纖維素酶與底物相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和催化的共性規(guī)律，可以為纖維素酶的理性設(shè)計(jì)指明方向。本文利用結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)技術(shù)平臺(tái)展開(kāi)了對(duì)GH5、GH7和GH12家族纖維素酶的研究，探究了底物扭曲與內(nèi)切纖維素酶分型的關(guān)系，分析了三個(gè)主要糖苷水解酶家族纖維素酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和序列保守性，并對(duì)活性架構(gòu)部位的關(guān)鍵亞位點(diǎn)氨基酸進(jìn)行功能研究，以進(jìn)一步闡明不同纖維素酶的作用機(jī)理。本文的主要內(nèi)容如下:
　　1.

3、糖苷水解酶活性架構(gòu)的結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)分析
　　目前，根據(jù)序列相似度30％的劃分原則，已經(jīng)建立了135個(gè)糖苷水解酶家族，每個(gè)家族都具有各自的空間結(jié)構(gòu)和催化模式。纖維素酶一般由多結(jié)構(gòu)域組成，催化結(jié)構(gòu)域中的活性架構(gòu)區(qū)域?qū)τ诘孜锏慕到獍l(fā)揮關(guān)鍵作用，分析活性架構(gòu)區(qū)域的序列與結(jié)構(gòu)特征對(duì)于研究纖維素酶的作用機(jī)理具有重要意義。本文主要對(duì)于GH5、GH7和GH12家族進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)不同家族的纖維素酶所作用的底物糖環(huán)具有明顯的差異性。而且，這三個(gè)家族

4、中纖維素酶活性架構(gòu)的氨基酸使用頻率具有一定的偏好性，-2亞位點(diǎn)氨基酸與底物糖環(huán)的相對(duì)位置和作用方式有所差異，這可能是導(dǎo)致三個(gè)糖苷水解酶家族纖維素酶差異性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　2.異源表達(dá)系統(tǒng)及重組酶的性質(zhì)分析
　　利用大腸桿菌和畢赤酵母兩種異源表達(dá)系統(tǒng)對(duì)于內(nèi)切纖維素酶TrCel5A(EGⅡ)進(jìn)行了異源表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)兩種系統(tǒng)表達(dá)的蛋白性質(zhì)基本一致。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的選取取決于兩個(gè)因素:一是PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中內(nèi)切纖維素酶TrCel5A的

5、結(jié)晶結(jié)構(gòu)來(lái)源于大腸桿菌異源表達(dá)系統(tǒng)，二是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有易操作、周期短的特點(diǎn)，這種體系可以快速獲得大量的突變體蛋白，提高突變實(shí)驗(yàn)的效率，為纖維素酶的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　3.TrCel5A酶分子活性架構(gòu)關(guān)鍵亞位點(diǎn)功能研究
　　GH5家族TrCel5A蛋白具有內(nèi)切纖維素酶活性，-2亞位點(diǎn)對(duì)于酶分子識(shí)別與催化底物起到重要的作用，因此，本文對(duì)于TrCel5A蛋白活性中心部位-2亞位點(diǎn)的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行了突變分析。酶活測(cè)定發(fā)現(xiàn)，氨

6、基酸不同的突變方式，導(dǎo)致酶活的變化幅度不同。TrCel5A蛋白-2亞位點(diǎn)的氨基酸主要利用苯環(huán)的疏水作用結(jié)合與催化底物，活性架構(gòu)中氨基酸與底物糖環(huán)之間結(jié)合力的改變導(dǎo)致產(chǎn)物譜中糖比例發(fā)生明顯變化。
　　4.TrCel7B酶分子活性架構(gòu)關(guān)鍵亞位點(diǎn)功能研究
　　GH7家族是最大的真菌糖苷水解酶家族，TrCel7B蛋白活性架構(gòu)-2亞位點(diǎn)的保守氨基酸，與底物糖環(huán)的C2和C3位上的羥基形成氫鍵，對(duì)纖維素底物的結(jié)合與催化起著非常關(guān)鍵的作用。