磷酸水解酶熒光探針的設(shè)計(jì)、合成及應(yīng)用.pdf

1、本文設(shè)計(jì)并合成了兩種小分子熒光探針，對(duì)兩者的光學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，并測(cè)試了其作為堿性磷酸酶探針的能力。結(jié)果證明4-（（E）-2-（4-（二氰基亞甲基）-4H-色烯-2-基）乙炔基）苯基磷酸單酯（探針P2）是一個(gè)比較理想的堿性磷酸酶探針。
　　探針P1基于常用的熒光團(tuán)氟硼染料（BODIPY），其合成以2,4-二甲基吡咯、對(duì)羥基苯甲醛、三氟化硼乙醚為起始原料先合成BODIPY主體，然后經(jīng)過(guò)縮合反應(yīng)構(gòu)成了探針的熒光團(tuán)部分。該染料在有機(jī)溶液

2、中具有很好的光學(xué)性質(zhì)，如具有較長(zhǎng)的最大吸收波長(zhǎng)，發(fā)射波長(zhǎng)位于近紅外區(qū)等。但是卻存在一個(gè)非常大的缺點(diǎn)，就是該染料的熒光在水溶液中會(huì)發(fā)生淬滅。對(duì)該染料進(jìn)一步修飾將磷酸基團(tuán)連接到染料主體上作為堿性磷酸酶的識(shí)別基團(tuán)得到探針P1。然而由于磷酸酯基不是很強(qiáng)的吸電子基團(tuán)，在二氯甲烷和乙酸乙酯溶液中探針與染料兩者之間的光學(xué)性質(zhì)相差并不大，只有在乙醇中其發(fā)射光譜具有較大的強(qiáng)度差別。由于探針P1不能在水溶液中檢測(cè)堿性磷酸酶，于是直接將其用于活細(xì)胞中堿性磷酸

3、酶的檢測(cè)。與其在二氯甲烷和乙酸乙酯中的光學(xué)性質(zhì)相似兩者在細(xì)胞內(nèi)也具有強(qiáng)度相同的熒光，因此探針P1不能作為磷酸酶探針。
　　吸取設(shè)計(jì)探針P1失敗的教訓(xùn)，在探針P2的設(shè)計(jì)時(shí)引入了雙氰基這一強(qiáng)拉電子基團(tuán)。該探針以鄰羥基苯乙酮為起始原料經(jīng)過(guò)多步縮合反應(yīng)而合成。由于在酚羥基與雙氰基之間存在強(qiáng)的分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移而發(fā)出熒光。而將磷酸基團(tuán)引入后酚羥基與雙氰基之間的強(qiáng)的電子轉(zhuǎn)移過(guò)程被抑制。由于磷酸基團(tuán)的吸電子能力較弱同時(shí)雙氰基的吸電子能力較強(qiáng)，兩者之

4、間的電子云密度還是存在較大差距，因此還是存在分子內(nèi)的電子轉(zhuǎn)移并不能完全抑制分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移過(guò)程，因此還會(huì)發(fā)出熒光，只是其發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生了很大的藍(lán)移（100 nm）。探針在緩沖溶液中的最大吸收波長(zhǎng)為440nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)550 nm。其熒光團(tuán)在相同條件下的最大吸收波長(zhǎng)為395 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為650 nm。因此探針P2可以作為一個(gè)比率熒光探針。測(cè)試結(jié)果表明，探針P2在Tris-HCl緩沖溶液中能夠定量的檢測(cè)堿性磷酸酶的濃度。兩個(gè)波長(zhǎng)處的

5、發(fā)射強(qiáng)度比率與磷酸酶濃度在在一定濃度范圍內(nèi)（50~200 U/L）呈現(xiàn)出很好的線性關(guān)系。經(jīng)過(guò)分析計(jì)算其最低檢測(cè)限達(dá)到了3.8U/L遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于人體內(nèi)正常的堿性磷酸酶濃度（40~150 U/L）。進(jìn)而把探針P2用于活細(xì)胞中堿性磷酸酶的檢測(cè)。共聚焦激光掃描顯微成像表明，使用探針P2孵育的海拉細(xì)胞可以在紅光通道內(nèi)觀察到熒光，而使用抑制劑和探針P2共同孵育的海拉細(xì)胞在紅光通道內(nèi)無(wú)法觀察到熒光。因此探針 P2可以用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶的分布情況。探