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1、本文設(shè)計(jì)并合成了兩種小分子熒光探針,對(duì)兩者的光學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究,并測(cè)試了其作為堿性磷酸酶探針的能力。結(jié)果證明4-((E)-2-(4-(二氰基亞甲基)-4H-色烯-2-基)乙炔基)苯基磷酸單酯(探針P2)是一個(gè)比較理想的堿性磷酸酶探針。
探針P1基于常用的熒光團(tuán)氟硼染料(BODIPY),其合成以2,4-二甲基吡咯、對(duì)羥基苯甲醛、三氟化硼乙醚為起始原料先合成BODIPY主體,然后經(jīng)過(guò)縮合反應(yīng)構(gòu)成了探針的熒光團(tuán)部分。該染料在有機(jī)溶液
2、中具有很好的光學(xué)性質(zhì),如具有較長(zhǎng)的最大吸收波長(zhǎng),發(fā)射波長(zhǎng)位于近紅外區(qū)等。但是卻存在一個(gè)非常大的缺點(diǎn),就是該染料的熒光在水溶液中會(huì)發(fā)生淬滅。對(duì)該染料進(jìn)一步修飾將磷酸基團(tuán)連接到染料主體上作為堿性磷酸酶的識(shí)別基團(tuán)得到探針P1。然而由于磷酸酯基不是很強(qiáng)的吸電子基團(tuán),在二氯甲烷和乙酸乙酯溶液中探針與染料兩者之間的光學(xué)性質(zhì)相差并不大,只有在乙醇中其發(fā)射光譜具有較大的強(qiáng)度差別。由于探針P1不能在水溶液中檢測(cè)堿性磷酸酶,于是直接將其用于活細(xì)胞中堿性磷酸
3、酶的檢測(cè)。與其在二氯甲烷和乙酸乙酯中的光學(xué)性質(zhì)相似兩者在細(xì)胞內(nèi)也具有強(qiáng)度相同的熒光,因此探針P1不能作為磷酸酶探針。
吸取設(shè)計(jì)探針P1失敗的教訓(xùn),在探針P2的設(shè)計(jì)時(shí)引入了雙氰基這一強(qiáng)拉電子基團(tuán)。該探針以鄰羥基苯乙酮為起始原料經(jīng)過(guò)多步縮合反應(yīng)而合成。由于在酚羥基與雙氰基之間存在強(qiáng)的分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移而發(fā)出熒光。而將磷酸基團(tuán)引入后酚羥基與雙氰基之間的強(qiáng)的電子轉(zhuǎn)移過(guò)程被抑制。由于磷酸基團(tuán)的吸電子能力較弱同時(shí)雙氰基的吸電子能力較強(qiáng),兩者之
4、間的電子云密度還是存在較大差距,因此還是存在分子內(nèi)的電子轉(zhuǎn)移并不能完全抑制分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移過(guò)程,因此還會(huì)發(fā)出熒光,只是其發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生了很大的藍(lán)移(100 nm)。探針在緩沖溶液中的最大吸收波長(zhǎng)為440nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)550 nm。其熒光團(tuán)在相同條件下的最大吸收波長(zhǎng)為395 nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)為650 nm。因此探針P2可以作為一個(gè)比率熒光探針。測(cè)試結(jié)果表明,探針P2在Tris-HCl緩沖溶液中能夠定量的檢測(cè)堿性磷酸酶的濃度。兩個(gè)波長(zhǎng)處的
5、發(fā)射強(qiáng)度比率與磷酸酶濃度在在一定濃度范圍內(nèi)(50~200 U/L)呈現(xiàn)出很好的線性關(guān)系。經(jīng)過(guò)分析計(jì)算其最低檢測(cè)限達(dá)到了3.8U/L遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于人體內(nèi)正常的堿性磷酸酶濃度(40~150 U/L)。進(jìn)而把探針P2用于活細(xì)胞中堿性磷酸酶的檢測(cè)。共聚焦激光掃描顯微成像表明,使用探針P2孵育的海拉細(xì)胞可以在紅光通道內(nèi)觀察到熒光,而使用抑制劑和探針P2共同孵育的海拉細(xì)胞在紅光通道內(nèi)無(wú)法觀察到熒光。因此探針 P2可以用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶的分布情況。探
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