磷酸水解酶熒光探針的設計、合成及應用.pdf

1、本文設計并合成了兩種小分子熒光探針，對兩者的光學性質進行了研究，并測試了其作為堿性磷酸酶探針的能力。結果證明4-（（E）-2-（4-（二氰基亞甲基）-4H-色烯-2-基）乙炔基）苯基磷酸單酯（探針P2）是一個比較理想的堿性磷酸酶探針。
　　探針P1基于常用的熒光團氟硼染料（BODIPY），其合成以2,4-二甲基吡咯、對羥基苯甲醛、三氟化硼乙醚為起始原料先合成BODIPY主體，然后經過縮合反應構成了探針的熒光團部分。該染料在有機溶液

2、中具有很好的光學性質，如具有較長的最大吸收波長，發(fā)射波長位于近紅外區(qū)等。但是卻存在一個非常大的缺點，就是該染料的熒光在水溶液中會發(fā)生淬滅。對該染料進一步修飾將磷酸基團連接到染料主體上作為堿性磷酸酶的識別基團得到探針P1。然而由于磷酸酯基不是很強的吸電子基團，在二氯甲烷和乙酸乙酯溶液中探針與染料兩者之間的光學性質相差并不大，只有在乙醇中其發(fā)射光譜具有較大的強度差別。由于探針P1不能在水溶液中檢測堿性磷酸酶，于是直接將其用于活細胞中堿性磷酸

3、酶的檢測。與其在二氯甲烷和乙酸乙酯中的光學性質相似兩者在細胞內也具有強度相同的熒光，因此探針P1不能作為磷酸酶探針。
　　吸取設計探針P1失敗的教訓，在探針P2的設計時引入了雙氰基這一強拉電子基團。該探針以鄰羥基苯乙酮為起始原料經過多步縮合反應而合成。由于在酚羥基與雙氰基之間存在強的分子內電子轉移而發(fā)出熒光。而將磷酸基團引入后酚羥基與雙氰基之間的強的電子轉移過程被抑制。由于磷酸基團的吸電子能力較弱同時雙氰基的吸電子能力較強，兩者之

4、間的電子云密度還是存在較大差距，因此還是存在分子內的電子轉移并不能完全抑制分子內電子轉移過程，因此還會發(fā)出熒光，只是其發(fā)射波長發(fā)生了很大的藍移（100 nm）。探針在緩沖溶液中的最大吸收波長為440nm，最大發(fā)射波長550 nm。其熒光團在相同條件下的最大吸收波長為395 nm，最大發(fā)射波長為650 nm。因此探針P2可以作為一個比率熒光探針。測試結果表明，探針P2在Tris-HCl緩沖溶液中能夠定量的檢測堿性磷酸酶的濃度。兩個波長處的

5、發(fā)射強度比率與磷酸酶濃度在在一定濃度范圍內（50~200 U/L）呈現出很好的線性關系。經過分析計算其最低檢測限達到了3.8U/L遠遠低于人體內正常的堿性磷酸酶濃度（40~150 U/L）。進而把探針P2用于活細胞中堿性磷酸酶的檢測。共聚焦激光掃描顯微成像表明，使用探針P2孵育的海拉細胞可以在紅光通道內觀察到熒光，而使用抑制劑和探針P2共同孵育的海拉細胞在紅光通道內無法觀察到熒光。因此探針 P2可以用于檢測細胞內堿性磷酸酶的分布情況。探