內皮祖細胞在股骨頭壞死發(fā)病機制及治療中的作用研究.pdf

1、第一部分
　　 目的：一旦發(fā)生股骨頭缺血性壞死，股骨頭局部血管的損傷和極弱的側枝循環(huán)必然導致預后較差。而循環(huán)內皮祖細胞主要維持血管的穩(wěn)定如血管修復和新生血管形成。本研究調查缺血性股骨頭壞死患者循環(huán)內皮祖細胞的數目和功能是否異常，并探討與股骨頭發(fā)生機制的關系。
　　 方法： 選擇2007－2008年就診54例非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者，其中激素誘發(fā)組21例，酒精誘發(fā)組15例，自發(fā)組18例；以及30例健康體檢者（對照組）。流式細

2、胞儀對循環(huán)內皮祖細胞計數，從外周血單個核細胞提取內皮祖細胞,在預鋪有人纖維連接蛋白培養(yǎng)板上培養(yǎng)，通過攝取Dil標記的乙?；兔芏戎鞍祝―il-ac-LDL）和 FITC標記的荊豆凝集素（FITC-UEA-1）對內皮祖細胞進行雙標記鑒定。54例患者及30例對照組均觀測內皮祖細胞集落形成能力。選每組年齡相匹配的10例檢測內皮祖細胞向趨化因子（血管內皮生長因子）的遷移能力，β-半乳糖苷酶檢測細胞衰老狀態(tài)，以及在Matrigel上形成連接小管

3、的數目檢測體外成血管能力。
　　 結果：股骨頭缺血性壞死患者循環(huán)內皮祖細胞的數目（1460±265個/毫升全血）較健康對照者（545±177個/毫升全血）顯著降低（(P<0.001）。其集落形成能力較健康對照組顯著下降（19.6±7.7vs26.2±6.2，P<0.001）。盡管激素組、酒精組、自發(fā)組之間循環(huán)內皮祖細胞數目和集落形成能力無統(tǒng)計學差異，激素組和酒精等危險因素均引起循環(huán)內皮祖細胞數目和集落形成能力的下降。此外與正常相

4、比，股骨頭缺血性壞死患者循環(huán)內皮祖細胞遷移能力下降，衰老增多，成血管能力也受損。
　　 結論：股骨頭缺血性壞死患者循環(huán)內皮祖細胞數目和功能均下降，表明股骨頭缺血性壞死的危險因素能改變內皮祖細胞的生物學性能并最終引起成血管及血管修復能力下降。
　　 第二部分
　　 目的：在血管新生及血管修復過程中，低氧誘導因子-1α是氧依賴型基因調節(jié)關鍵因子。激活低氧誘導因子-1α的表達，能促進內皮祖細胞對低氧誘導的病理生理過程(

5、如缺血性疾病)的血管修復。本研究觀察激活低氧誘導因子-1α的激活劑，二甲基乙二?；拾彼釋ν霉撬鑳绕ぷ婕毎脑鲋澈凸δ艿纳飳W影響，并探討其可能的生物學機制。
　　 方法：從兔骨髓單個核細胞分離、培養(yǎng)提取EPCs。以不同濃度(0μM、50μM、100μM、200μM、500μM、1000μM)的二甲基乙二?；拾彼?DMOG)干預EPCs，激活激活低氧誘導因子-1α，MTT檢測其增殖活性，觀察細胞形成集落能力并計數。采用免疫印跡

6、方法檢測細胞內低氧誘導因子-1α的蛋白表達。EPCs 生成一氧化氮(NO)的產量由Griess法測定。EPCs分泌的VEGF和 SDF-1由Elisa試劑盒檢測。同時檢測內皮祖細胞向趨化因子(血管內皮生長因子)的遷移能力，β-半乳糖苷酶檢測細胞衰老狀態(tài)，以及在Matrigel上形成連接小管的數目檢測體外成血管能力。
　　 結果：低氧誘導因子-1α的激活劑，二甲基乙二酰基甘氨酸能顯著激活EPCs中HIF-1α蛋白表達，6h表達達到

7、高峰。DMOG能顯著增加細胞的增長率及活性，且成劑量依賴關系，其中500μM濃度的DMOG對EPCs增殖作用達到峰值。DMOG能明顯促進EPCs 生成一氧化氮及分泌VEGF和 SDF-1，但均可被HIF-1α抗體中和。同時DMOG增加EPCs集落形成能力(P<0.001)，抑制細胞的衰老(P<0.05)，并顯著提高EPCs的的遷移能力和體外成血管功能。
　　 結論：低氧誘導因子-1α的激活劑能顯著提高內皮祖細胞增殖能力，以及細胞

8、集落形成能力、遷移能力和成血管功能，該激活劑刺激低氧誘導因子-1α，介導內皮祖細胞生成一氧化氮，并分泌VEGF和 SDF-1。因此低氧誘導因子-1α的激活劑介導的EPCs細胞治療具有廣泛的應用前景。
　　 第三部分
　　 目的在血管新生及血管修復過程中，低氧誘導因子-1α是氧依賴型基因調節(jié)關鍵因子。激活低氧誘導因子-1α的表達，能在體內外改善內皮祖細胞功能，并發(fā)揮對低氧誘導的病理生理過程（如缺血性疾?。┑募毎委?。本研究

9、觀察激活低氧誘導因子-1α的激動劑，二甲基乙二?；拾彼幔―MOG）對激素性兔壞死的療效觀察，探討內皮祖細胞在此過程過程中發(fā)揮的生物學作用。
　　 方法： 采用低劑量的脂多糖聯(lián)合高劑量的甲強龍（L-LPS×2+H-MPS×3）建立兔骨壞死模型，分為治療組和對照組。治療組兔肌肉注射DMOG 20mg/kg，1，3，5，7 間斷干預1周；對照組給予等量的生理鹽水。采集實驗動物標本前抽取外周血液，流式檢測循環(huán)內皮祖細胞數目。干預后4周

10、提取實驗動物雙側股骨，制成石蠟切片和硬組織切片，以進行免疫組織化學、組織學和組織形態(tài)學檢測，分析DMOG治療骨壞死的療效，評估組織形成新生血管及成骨能力。
　　 結果：低氧誘導因子-1α的激活劑，二甲基乙二?；拾彼崮苊黠@改善骨壞死，促進壞死區(qū)新骨形成，提高血管密度，激活壞死骨組織中的HIF-1α蛋白表達。DMOG能顯著增加血管的新生，其血管密度明顯較對照組提高（14.7±4.1vs5.8±2.3，P<0.001）。組織學分析顯

11、示還說明DMOG能明顯促進壞死組織的新生骨形成(5.86±1.24vs2.71±0.93，P<0.05)。同時DMOG增加外周內皮祖細胞的數目，提高壞死區(qū)域中歸巢內皮祖細胞的數目。
　　 結論：DMOG能激活壞死組織低氧誘導因子-1α蛋白的表達，顯著改善骨壞死，提高骨新生能力及血管新生能力。DMOG通過動員釋放并遷移內皮祖細胞到缺血的壞死組織，從而提高壞死組織血管新生以達到治療的效果。因此低氧誘導因子-1α的激活劑介導的EPCs