枝孢霉脂肪酶的定向進(jìn)化.pdf

1、脂肪酶在食品、油脂、洗滌劑和制藥等工業(yè)中具有廣泛應(yīng)用。在洗滌劑中添加脂肪酶用來水解油脂污漬;在生物柴油的制備中可以作為催化劑。然而洗滌劑中的陰離子表面活性劑和制備生物柴油的底物甲醇都能分別影響脂肪酶的活性。本文采用定向進(jìn)化方法來提高枝孢霉（Cladosporiumsp.）脂肪酶對甲醇或陰離子表面活性劑的耐受性。
　　本文用易錯PCR法構(gòu)建了枝孢霉脂肪酶的基因變體庫，并通過畢赤酵母（Pichiapastoris）表達(dá)出突變脂肪酶。首

2、先用羅丹明B平板初步篩選出陽性表達(dá)株，再用BMMY/三丁酸甘油酯雙層平板法篩選出甲醇耐受性提高的突變脂肪酶，最后通過搖瓶發(fā)酵獲得若干突變脂肪酶的酶液，對酶液進(jìn)行甲醇耐受性檢測和SDS耐受性檢測，從中篩選出性質(zhì)突出的脂肪酶突變體。
　　第467號突變脂肪酶（簡稱＃467）提高了甲醇耐受性，在三批甲醇濃度范圍不同的實驗中，＃467在42.5％和45％的甲醇濃度下耐受性表現(xiàn)最為顯著，分別較野生型提高了39.8％和68.7％。突變的氨基酸

3、是110位的異亮氨酸變?yōu)樘K氨酸，355位的谷氨酸變?yōu)橘嚢彼帷?br>　　第496號突變脂肪酶（簡稱＃496）提高了對多種陰離子表面活性劑的耐受性，對SDS（十二烷基磺酸鈉）的耐受性約為野生型的2.5倍，對AOS（α-烯基磺酸鈉）耐受性約為野生型的2倍，對LAS（直鏈烷基苯磺酸鹽）、AES（脂肪醇聚氧乙烯醚磺酸鹽）耐受性約為野生型的1.5倍，突變的氨基酸是377位賴氨酸變?yōu)楣劝彼?。隨后對496的第377位氨基酸進(jìn)行了飽和突變，替換為天冬氨