中性蛋白酶發(fā)酵過程代謝物動態(tài)變化的研究.pdf

1、分類號：[Q815]密級：不保密學校代碼：10057研究生學號：12809004中性蛋白酶發(fā)酵過程代謝物動態(tài)變化的研究StudyontheDynamicChangesofMetabolitesDuringFermentationProcessofNeutralProtease專業(yè)名稱：發(fā)酵工程指導教師姓名：路福平教授研究生姓名：楊泓酤申請學位級別：工學碩士論文提交日期：2015年5月論文課題來源：863計劃項目學位授予單位：天津科技大學

2、摘要芽胞桿菌屬微生物發(fā)酵生產的中性蛋白酶在食品、釀造、紡織、化工等工業(yè)上具有廣泛的應用，全面深入地研究其發(fā)酵過程，能夠促進發(fā)酵工藝的理性優(yōu)化和改良，對于降低其生產成本具有重要的意義。本研究致力于解析芽胞桿菌ASl398(肋cf刀淞J甜6，玎括ASl398)中性蛋白酶發(fā)酵工程中胞內、胞外物質的動態(tài)變化，首先利用氣相一質譜聯(lián)用(GCMS)技術建立了移s甜6ff凰ASl398菌種的代謝組分析方法，然后通過該方法對中性蛋白酶發(fā)酵過程中胞內外代謝

3、物的動態(tài)變化進行了探索研究，并從中尋找限制發(fā)酵進程和產酶水平的關鍵氨基酸種類。具體研究工作包括如下幾個方面：(1)通過比較建立了適合枯草芽胞桿菌的基于GCMS的代謝組學分析方法，著重考察了淬滅方法、細胞破碎方法和衍生時間三個條件，最終確定了適合的代謝組樣品前處理方法：采用預冷的60％甲醇／09％碳酸銨溶液淬滅、珠磨法破碎細胞和MSTFA衍生2h，該方法從枯草桿菌中共鑒定到223種代謝物，包含了大量的氨基酸、有機酸和糖類物質。(2)利用L

4、B培養(yǎng)基對丑J甜施脅ASl398進行清液搖瓶發(fā)酵，每隔2h采樣測定生長曲線和產酶活力變化，并進行基于GCMS的代謝組分析。生長曲線顯示，菌體在前12h處于對數(shù)生長期，1218h處于穩(wěn)定期。產酶活力曲線顯示，發(fā)酵210h產酶活力速度提高，1022h緩慢提高。代謝組分析分別檢測到胞內外123種和104種物質在22h發(fā)酵過程中的動態(tài)變化，通過PCA統(tǒng)計學分析，發(fā)現(xiàn)細胞內外賴氨酸、蛋氨酸等多種氨基酸物質存在顯著變化，暗示他們與發(fā)酵和產酶進程存在

5、密切的關系。(3)采用溶解性較差的工業(yè)培養(yǎng)基對Bs甜6療凰ASl398進行發(fā)酵產酶實驗，多個時間點取樣測定生長曲線和產酶活力變化，并進行基于GCMS的代謝組分析。生長曲線顯示，前6h為停滯期，1238h為對數(shù)生長期，38h之后，進入穩(wěn)定期。產酶活力曲線顯示，產酶活力前18h緩慢提高，1836h提高速度明顯加快，第36h時達到最高4232U／mL，之后開始降低。代謝組分析分別共檢測到細胞外121種物質在42h內的動態(tài)變化。通過PCA統(tǒng)計學

6、分析，發(fā)現(xiàn)細胞外賴氨酸、蛋氨酸等多種氨基酸物質存在顯著變化，暗示他們與發(fā)酵和產酶進程存在密切的關系。(4)結合代謝物動態(tài)變化分析結果，根據(jù)豆粕培養(yǎng)基的氨基酸組成和中性蛋白酶的氨基酸組成，分析發(fā)酵過程中氨基酸的供應比例和需求比例之間的平衡性，推測可能由于蛋氨酸、賴氨酸、谷氨酸和組氨酸的供應不足限制了中性蛋白酶的生物合成。針對這些推測，通過補加氨基酸的搖瓶發(fā)酵實驗進行驗證。結果發(fā)現(xiàn)，添加075％的蛋氨酸能夠提高酶表達量673％，添加O5％的