一種檢測兒茶酚-O-甲基化轉移酶熒光探針的設計合成及其生物應用.pdf

1、COMT（Catechol-O-methyltransferase，兒茶酚-O-甲基轉移酶）是人體內一種重要的的二相代謝酶，可以代謝內源性和外源性兒茶酚類化合物，對機體的防御也起著重要的作用。COMT的催化功能（即活性）是其在機體發(fā)揮功能的前提條件，COMT催化功能的失常會導致人體多種疾病的發(fā)生甚至死亡。因此，評價和表征COMT催化功能十分重要。基于特異性探針分子檢測目標酶催化功能的手段已得到普遍認同，但現行COMT催化功能表征探針及檢

2、測體系受以下條件制約或有以下缺陷:1.原理上，需要定量檢測酶代謝的專一產物，特別是單一產物的生成量，而不是底物的減少量;2.COMT具有兩種形式，在生理狀態(tài)下底物的選擇性并沒有差異，所以對COMT活性的評價是同時評價兩種類型COMT的活性;3.COMT即是膜蛋白也是游離蛋白，其催化功能需要膜結構的完整性或胞漿和輔因子的存在，反應體系的復雜性影響到不同生物基質或/和內源性物質對COMT催化表征的穩(wěn)定性和抗干擾性;4.COMT活性常常需要活

3、細胞水平的檢測，因此，底物探針或者代謝產物不能對活性細胞體系形成毒性傷害;5.已報道的COMT探針底物均為非熒光底物，未經理性設計和優(yōu)化，反應檢測體系需要借助高效液相色譜-紫外或高效液相色譜-質譜等大型貴重儀器來實現產物的分離與檢測，具有流程繁瑣、測試通量低、成本高、生物基質干擾大等缺陷。
　　針對上述在選擇性、穩(wěn)定性、靈敏性、抗干擾性、實用性等方面的挑戰(zhàn)和限制，本論文開展了以下工作，1.以高靈敏性和抗干擾性較好的香豆素熒光分子為

4、母體，構建了4位取代不同，極性大小不同的小分子熒光化合物庫8個，最終發(fā)現COMT能夠高選擇性的將探針DHMC（4-methyl-7，8-dihydroxycoumarin，7，8-二羥基-4-甲基香豆素）甲基化成HMMC（4-methyl-7-hydroxy-8-methoxycoumarin，7-羥基-8-甲氧基-4-甲基香豆素）;2.利用體外重組單酶，系統(tǒng)研究了探針對底物的選擇性;3.結合COMT偏好的底物結構特征，通過選擇香豆素7

5、，8位兒茶酚COMT代謝的傾向性和代謝選擇性，發(fā)現COMT選擇性代謝8位羥基，只產生一個產物;4.對COMT熒光底物及其相應甲基化產物的探針性能，包括熒光量子產率、pH穩(wěn)定性、激發(fā)和發(fā)射波長等和COMT酶反應動力學特征進行了系統(tǒng)評估，發(fā)現熒光探針具有很好的穩(wěn)定性和抗干擾能力;5.將新發(fā)現的探針和反應檢測體系進行了生物應用，包括1）人源性組織或生物樣本中COMT酶活的定量測定，結果發(fā)現COMT活性檢測與傳統(tǒng)COMT定量方法結果一致;2）人