透明質(zhì)酸酶誘導(dǎo)表達對透明質(zhì)酸產(chǎn)量影響的研究.pdf

1、透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，HA)，又名玻璃酸，是一種大分子量、線性粘多糖，廣泛應(yīng)用于化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)。工業(yè)上發(fā)酵生產(chǎn)HA的主要菌株是獸疫鏈球菌（Streptococcus equi subsp.zooepidemicus），菌株莢膜主要成分就是HA。目前，透明質(zhì)酸的生產(chǎn)方法有動物組織提取法和微生物發(fā)酵法，更受歡迎的是微生物發(fā)酵法。但是，高發(fā)酵黏度和低溶氧傳遞率是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)HA的主要限制因素。獸疫鏈球菌缺乏完整電子

2、傳遞鏈，無法進行有氧磷酸化，產(chǎn)能水平較低，且HA合成是高耗能過程，因此若能有效提高其溶氧水平，必將提高HA產(chǎn)量。本研究以獸疫鏈球菌ATCC39920為研究對象，通過透明質(zhì)酸酶基因的誘導(dǎo)表達以及兩步法發(fā)酵模式，探究對HA產(chǎn)量的影響。主要研究結(jié)果如下:
　　1、構(gòu)建并分析蔗糖誘導(dǎo)表達系統(tǒng)
　　把獸疫鏈球菌ATCC39920內(nèi)穩(wěn)定復(fù)制質(zhì)粒pLH243(本實驗室構(gòu)建完成)作為出發(fā)載體，插入scrR-PscrA調(diào)控元件，構(gòu)建質(zhì)粒pLH

3、256(即pLH243∷scrR-PscrA)。然后在調(diào)控元件scrR-PscrA后分別插入基因片段構(gòu)建蔗糖誘導(dǎo)表達載體pLH268(pLH256∷SamyA-hylA)、pLH278(pLH256∷SamyA-hylB)、pLH279(pLH256∷ShulB-hylB)。通過對誘導(dǎo)表達系統(tǒng)分析知:帶有質(zhì)粒pLH278的菌株的HA產(chǎn)量最高，比野生型菌株的HA產(chǎn)量提高17％左右。
　　2、建立可控兩步法生產(chǎn)HA的發(fā)酵模式
　

4、　將質(zhì)粒pLH268、pLH278、pLH279電轉(zhuǎn)入獸疫鏈球菌野生型菌株S12中，構(gòu)建S218(S12/pLH268)、S239(S12/pLH278)、S240(S12/pLH279)菌株。根據(jù)本論文提出的可控兩步法發(fā)酵模式:0-10h添加初始濃度為30 g/L的葡萄糖，葡萄糖作為碳源，獲得高密度菌體。10-24 h添加初始濃度為20 g/L的蔗糖，蔗糖同時作為碳源和誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)表達透明質(zhì)酸酶，改善發(fā)酵高黏度環(huán)境，收獲HA。經(jīng)過兩步