鋅轉運體ZnTs在小鼠內分泌細胞中的表達及ZnT8參與睪酮合成的分子機制.pdf

1、前言:
　　 鋅是哺乳動物中含量第二豐富的微量元素，參與許多生物學功能，包括:生長，發(fā)育，生殖，免疫等。鋅在人和動物的新陳代謝中發(fā)揮重要作用，從生化學角度，鋅參與調控300多種酶，這些酶參與中間代謝，DNA和RNA合成，基因表達和免疫活性;從激素的穩(wěn)態(tài)角度，鋅也具有重要作用，鋅和幾乎所有的激素可以相互作用。密切相關的有:甲狀腺素，甲狀旁腺激素，胰島素，垂體激素，雄激素和雌激素等。鋅離子在胰島β細胞中高表達，并且在胰島素分泌小泡中

2、參與胰島素結晶，也參與垂體中催乳素和腎上腺皮質激素的分泌。鋅缺乏使血清中甲狀腺素T3水平下降，同時抑制雄性激素和雌激素的合成與分泌。大量的研究表明，鋅同男性生殖的健康和疾病也有著密切的關系。睪酮的合成需要多種與鋅有關的酶的參與才能完成，在睪丸Leydig細胞中，睪酮是由膽固醇經一系列酶催化作用轉化而成的，細胞色素P450膽固醇側鏈裂解酶(P450scc)，3羥甾脫氫酶(3βHSD)，細胞色素P45017α-羥化酶(P450α17)和17

3、β-羥甾脫氫酶(17ββHSD)這4種酶是睪酮生成的基本酶。因而鋅缺乏可使睪酮合成減少，并且缺鋅對睪丸有特殊損害作用，鋅缺乏狀態(tài)下，實驗動物間質細胞壞死，數(shù)量減少，影響Leydig細胞產生和分泌睪酮。缺鋅還可導致DNA、RNA聚合酶活性降低，DNA、RNA和蛋白質合成障礙，使細胞增殖受阻，膽固醇催化酶活性降低，也影響促性腺激素的分泌，睪酮及其運輸載體蛋白的合成，最終導致睪酮合成障礙。
　　 鋅離子不能通過被動擴散跨越生物膜，在哺

4、乳動物中由鋅轉運體(ZnTsand Zips)來調節(jié)鋅離子的跨膜運動，鋅轉運體ZnT家族是一組具有六個跨膜區(qū)域并富含組氨酸的結構和功能相近的蛋白質，其主要功能是促進細胞質內的鋅離子轉運到細胞膜外或者轉運到胞內細胞器中，從而達到降低胞內鋅離子的作用。ZnT家族包含10個家族成員，即ZnT1-10，它們與鋅離子穩(wěn)態(tài)調節(jié)密切相關。ZnT家族的表達與分布具有組織特異性。近年研究表明，ZnT8主要定位于胰島β細胞的分泌囊泡膜上，由369個氨基酸組

5、成，是胰島的特異性鋅離子轉運蛋白。其功能是特異性的向分泌囊泡內轉運鋅離子，使鋅離子在囊泡內聚集，調節(jié)胰島素的合成、儲存和分泌。近期研究表明，ZnT8也表達在胰島α細胞和其他內分泌細胞，包括甲狀腺濾泡上皮細胞和腎上腺皮質細胞。ZnT8與內分泌系統(tǒng)的功能密切相關，這提示其他ZnTs是否也與內分泌細胞密切相關。同時，鋅轉運蛋白1、3、7、8在男性生殖系統(tǒng)均有表達。此前的研究中證實小鼠睪丸中ZnT7表達廣泛，并且ZNT7和鋅離子分布在曲細精管內

6、不同種類的細胞中。此前，研究中證實ZnT7將細胞質內鋅離子轉運進高爾基體，并可能參與了高爾基體對蛋白質的修飾加工。這也提示與內分泌密切相關的ZnT8是否與雄激素睪酮的合成和分泌具有相關性。
　　 睪丸間質細胞合成的睪酮是確保精子生成、維持正常性欲和雄性第二性征所必需的類固醇激素。大部分睪酮由睪丸的間質細胞產生，睪丸中的睪酮水平是血清中的睪酮水平的10倍。LH/hCG是調節(jié)睪酮生物合成的主要激素， LH/hCG調節(jié)睪酮合成包括快速

7、和慢性兩種作用方式。LH/hCG刺激LH受體30-60分鐘后，導致cAMP的水平快速和慢性上升，隨后PKA被激活，激活的PKA信號誘導EGFP非依賴性配體所導致的MAPK信號通路的激活。MAPK的激活導致現(xiàn)有的少量StAR磷酸化和轉移到線粒體內膜，引起類固醇的生成增多。但是LH/hCG調節(jié)睪酮合成的快速作用機制目前還不是很清楚。在慢性調節(jié)期，間質細胞需要LH/hCG保持其完全分化的結構和功能，2小時之后，慢速PKA信號導致StAR的mR

8、NA轉錄水平升高，隨后StAR蛋白表達增高，MAPK的顯著信號不再引起StAR磷酸化和轉移到線粒體內膜。StAR蛋白(Steroidogenic Acute Regulatory Protein，類固醇合成快速調節(jié)蛋白)是調節(jié)這一步驟的關鍵性因子。文獻證實，幼年及成年小鼠或者大鼠注射生理劑量的LH/hCG后，可誘發(fā)血清睪酮濃度上升。體外原代培養(yǎng)的睪丸間質細胞，給予LH/hCG刺激后，可分泌睪酮，并在一定范圍內，分泌睪酮量與LH/hCG的

9、濃度呈正相關。
　　 綜上所述，鋅在內分泌細胞中豐富表達，為深入探討鋅在內分泌細胞中鋅穩(wěn)態(tài)的內在機制和ZnTs在內分泌細胞中的表達與分布，并驗證鋅和ZnTs與相關激素的合成和分泌的相關作用。本研究以CD1小鼠為實驗對象，檢測鋅和ZnT1-10在小鼠垂體、腎上腺、甲狀腺、胰腺、睪丸和卵巢中的表達和分布;同時本實驗旨在探討ZnT8介導的鋅離子轉運參與hCG誘導的小鼠睪丸間質細胞的睪酮生成的影響及其機制，并進一步驗證ZnT8介導睪酮的

10、生成是通過快速通路還是慢性通路，以及鋅及ZnT8影響睪酮合成時所作用的相關酶，從而揭示ZnT8參與類固醇激素合成過程中的證據(jù)及機制。
　　 實驗方法:
　　 1、鋅和鋅轉運體ZnTs在小鼠內分泌細胞中的表達與分布的研究
　　 28只CD1小鼠（8-10周，重約30克，雄性14只，雌性14只），應用金屬自顯影(AMG, autometallography)檢測zinc在具有內分泌功能的器官（垂體，腎上腺，甲狀腺，胰

11、腺，睪丸和卵巢）中的分布。應用Real time PCR和免疫組化技術檢測ZnTs mRNA和蛋白在上述具有內分泌功能的器官中的表達和分布。
　　 2、鋅轉運體ZnT8參與睪酮分泌的分子機制研究
　　 雄性CD1乳鼠（15天，重約9克）給予hCG處理后，應用共聚焦激光掃描顯微鏡檢測ZnT8與StAR在睪丸間質細胞中的表達與分布;應用AMG和免疫組化技術等檢測hCG對乳鼠血清睪酮濃度，睪丸間質細胞鋅離子，ZnT8表達的影響

12、。小鼠睪丸間質細胞瘤細胞（MLTC-1）給予高鋅、低鋅、ZnT8過表達質粒轉染和siRNA干擾處理后，檢測孕酮水平，cAMP，PKA活性的水平，以及鋅離子分布的變化;應用Western blot技術檢測ZnT8、StAR和P-StAR以及睪酮合成過程快速通路和慢性通路中的酶的表達，以及cAMP-PKA途徑和MAPK通路中的相關蛋白的表達。
　　 實驗結果:
　　 一、鋅和鋅轉運體ZnTs在小鼠內分泌細胞中的表達
　

13、　 1、ZnT1-10 mRNA在小鼠具有內分泌功能的器官（垂體，腎上腺，甲狀腺，胰腺，睪丸和卵巢）中的表達
　　 Real time PCR結果顯示，ZnT1-10 mRNA在小鼠具有內分泌功能的器官（垂體，甲狀腺，胰腺，腎上腺，睪丸和卵巢）中均有表達，但是表達含量不同，只有ZnT10 mRNA在胰腺中沒有表達。ZnT1 mRNA在垂體和甲狀腺中高表達，在胰腺表達量最低。ZnT2 mRNA在垂體和卵巢中表達量相對最低。ZnT

14、3 mRNA的表達量在甲狀腺和睪丸中較高，在垂體，胰腺，腎上腺和卵巢中表達量極低，幾乎檢測不到。ZnT4 mRNA和ZnT6 mRNA在檢測的器官中表達情況相似，甲狀腺和睪丸中高表達，ZnT4 mRNA在卵巢中次之，也高于其他器官，其余器官的表達水平相似，而ZnT6 mRNA在垂體和卵巢中表達高于胰腺和腎上腺。ZnT5 mRNA表達量在垂體，甲狀腺，胰腺，睪丸，腎上腺和卵巢中依次遞減。ZnT7 mRNA在睪丸中表達最高，垂體和胰腺次之，

15、在其余器官中低表達。ZnT8 mRNA的表達水平在胰腺中最高，在其他的內分泌器官也有表達，但是表達水平顯著低于胰腺。ZnT9mRNA豐富表達在垂體和卵巢，高于其他器官的表達水平。ZnT10 mRNA在被檢測器官中的表達水平最低，低于其他的ZnTs mRNA，ZnT10 mRNA在垂體中相對高表達，在胰腺中不表達。
　　 2、ZnT1-10蛋白在小鼠具有內分泌功能的器官（垂體，腎上腺，甲狀腺，胰腺，睪丸和卵巢）中的分布
　　

16、 (1) ZnTs蛋白在腺垂體中的分布
　　 除了ZnT10，其他ZnT1-5，ZnT7和ZnT8蛋白均分布在腺垂體的嗜酸性細胞和嗜堿性細胞胞質中，ZnT3-5和ZnT8在嫌色細胞中也有陽性反應，但是ZnT1，ZnT2與ZnT7只有微弱陽性染色或陰性的反應。
　　 (2) ZnTs蛋白在腎上腺中的分布
　　 所有的ZnTs均在腎上腺中表達，ZnT1，ZnT3，ZnT4，ZnT7和ZnT8分布在腎上腺皮質的球狀帶

17、，束狀帶和網狀帶細胞中，ZnT2，ZnT5和ZnT10在球狀帶的陽性反應較弱，ZnT1，ZnT3，ZnT7和ZnT8在腎上腺髓質中高表達，ZnT4，ZnT5和ZnT10在腎上腺髓質中呈陰性反應。
　　 (3) ZnTs蛋白在甲狀腺中的分布
　　 除了ZnT10，其他ZnT1-5，ZnT7和ZnT8蛋白均分布在甲狀腺濾泡上皮細胞和濾泡旁細胞的細胞質中。
　　 (4) ZnTs蛋白在胰腺中的分布
　　 除了Z

18、nT10，其他ZnT1-5，ZnT7和ZnT8蛋白在胰島細胞胞質中均呈陽性免疫反應，但是ZnT3的免疫染色較弱。
　　 (5) ZnTs蛋白在睪丸中的分布
　　 所有的ZnTs均表達在睪丸間質細胞中的細胞質，ZnT7也高表達在曲細精管中的精母細胞和精子細胞。
　　 (6) ZnTs蛋白在卵巢中的分布
　　 除了ZnT10，其他ZnT1-5，ZnT7和ZnT8高表達在不同時期卵泡細胞中的顆粒細胞，所有的Zn

19、Ts在卵巢黃體中均有強烈的免疫陽性染色反應。
　　 3、zinc在小鼠具有內分泌功能的器官（垂體，腎上腺，甲狀腺，胰腺，睪丸和卵巢）中的表達
　　 AMG實驗表明在所檢測的內分泌細胞的細胞質中均有棕褐色的AMG陽性產物，表明zinc分布在腺垂體細胞，腎上腺皮質細胞，甲狀腺濾泡上皮細胞和濾泡旁細胞，胰島細胞，睪丸間質細胞，曲細精管，卵巢的卵泡顆粒細胞和黃體。二、鋅轉運體ZnT8參與睪酮分泌的分子機制研究
　　 1、

20、免疫熒光雙標實驗證實ZnT8蛋白和StAR蛋白在小鼠和人的睪丸間質細胞中共定位。
　　 ZnT8蛋白和StAR蛋白在小鼠和人的睪丸間質細胞中共定位。
　　 2、ZnT8參與hCG誘導的小鼠睪丸間質細胞睪酮生成。
　　 hCG處理乳鼠后，乳鼠血清睪酮濃度升高，睪丸間質細胞鋅離子聚集增多，ZnT8蛋白表達水平增多，同時刺激了StAR蛋白的產生。
　　 3、ZnT8介導小鼠睪丸間質細胞瘤細胞（MLTC-1）的鋅

21、離子轉運
　　 小鼠睪丸間質細胞瘤細胞(MLTC-1)給予高鋅、低鋅、hZnT8過表達質粒轉染和mZnT8 siRNA干擾處理后，觀察到高鋅組和ZnT8過表達質粒轉染組細胞所分泌的孕酮水平升高，低鋅組和mZnT8 siRNA干擾組孕酮水平降低，并且這種變化與hCG處理時間呈正比。同時，TSQ熒光染色實驗顯示hCG處理組，高鋅組和ZnT8過表達質粒轉染組使MLTC-1細胞中鋅離子聚集增多，而低鋅組和mZnT8 siRNA干擾組使鋅

22、聚集減少。
　　 4、證實ZnT8介導睪酮的生成是通過快速通路還是慢性通路。
　　 小鼠睪丸間質細胞瘤細胞（MLTC-1）給予高鋅、低鋅、hZnT8過表達質粒轉染和mZnT8 siRNA干擾處理后，Western blot結果顯示快速通路中P-StAR蛋白在高鋅組和ZnT8過表達質粒轉染組表達升高，總StAR蛋白在各組間沒有變化;慢性通路中總StAR，3β-HSD和P450scc均在低鋅組表達降低，這說明ZnT8介導睪酮

23、的生成是通過快速通路。
　　 5、不同處理因素對MLTC-1細胞中cAMP-PKA途徑和P-ERK1/2表達水平的影響。
　　 不同處理因素組對MLTC-1細胞的cAMP和PKA水平引起變化，但是沒有統(tǒng)計學意義;Western blot結果顯示P-ERK1/2蛋白在高鋅組和ZnT8過表達質粒轉染組表達升高，低鋅組和mZnT8 siRNA干擾組P-ERK1/2蛋白水平降低，同時在不同處理因素后應用ERK抑制劑PD98059

24、，孕酮水平的變化被PD98059所抑制，說明ZnT8在快速通路中通過激活ERK的級聯(lián)反應進行調節(jié)StAR的磷酸化參與睪酮合成的分子機制。
　　 結論:
　　 1、在具有內分泌功能的器官（垂體，腎上腺，甲狀腺，胰腺，睪丸和卵巢）中
　　 (1) ZnT1-10 mRNA均有表達，但是表達含量不同，ZnT10 mRNA在胰腺中沒有表達。
　　 (2) ZnT1-5，ZnT7和ZnT8蛋白也均有表達，含量及組織