急性排斥反應的實驗研究.pdf

1、第一部分:
　　 目的：研究Th17細胞及其相關細胞因子IL-17在小鼠心臟移植急性排斥反應中的表達及意義。
　　 方法：建立小鼠頸部異位心臟移植模型，C57小鼠作為受體，BALB/c小鼠作為供體或受體，實驗動物隨機分為同系移植組和同種異體移植組，觀察2組移植心臟的存活時間。應用realtime-PCR檢測各組移植心臟中IL-17、RORγt、IFN-γ mRNA在移植術后第1天至第7天的動態(tài)表達水平；Western b

2、lot 檢測各組移植心臟中IL-17、RORγt、IFN-γ在移植術后第1、3、5、7天的表達水平；HE染色檢測移植術后第7天各組移植物中淋巴細胞浸潤情況；免疫熒光法觀察同種異體移植組術后第7天移植心臟中CD4+、CD8+T細胞的浸潤情況，并檢測CD4+、CD8+T細胞中細胞因子IL-17的表達。
　　 結果：同種異體移植組中，IL-17和RORγt mRNA的表達均早于IFN-γ，在移植術后第1天即可于移植心臟中檢測到兩者的表

3、達，而IFN-γ mRNA在移植術后第2天才可檢測到表達，三者mRNA的轉錄水平伴隨移植排斥反應的進程均逐漸升高。Western blot 檢測各組移植物中IL-17、RORγt、IFN-γ蛋白表達亦得出相似的結果。免疫熒光結果顯示，移植術后第7天同種異體移植組移植心臟中有大量CD4+、CD8+T細胞浸潤，而細胞因子IL-17主要由CD4+T細胞即Th17細胞分泌。
　　 結論：Th17細胞參與了小鼠同種異體心臟移植急性排斥反應

4、的發(fā)生和發(fā)展，對移植臟器中細胞因子IL-17的檢測可作為急性排斥反應早期診斷的預見性和特異性指標。
　　 第二部分:
　　 目的：觀察應用anti-IL-6 mAb對同種異體小鼠心臟移植急性排斥反應的抑制作用，并探討其可能的作用機制。
　　 方法：以Balb/c和C57小鼠分別作為供受體，建立小鼠心臟移植急性排斥反應模型。實驗動物隨機分為anti-IL-6 mAb組、anti-IL-17 mAb組及rat-IgG

5、對照組，術后每日通過觸診受鼠頸部移植心臟觀察各組小鼠移植心臟存活時間并結合組織學檢測。應用realtime-PCR檢測各組移植心臟中細胞因子IL-17、IFN-γ及Th17細胞特異性轉錄因子RORγt mRNA表達水平，流式細胞術分別檢測各組受鼠脾臟CD4+、CD8+T細胞中IL-17、IFN-γ的表達。
　　 結果：Anti-IL-6 mAb、anti-IL-17 mAb輸注均可顯著抑制小鼠急性排斥反應的發(fā)生，移植心臟存活時間

6、分別延長至（22.0±2.3天）、（13±1.8天），anti-IL-6 mAb組抑制排斥反應發(fā)生的效果更加顯著。組織病理學結果顯示anti-IL-6 mAb輸注可減輕移植心肌結構的破壞，移植心臟中浸潤的淋巴細胞明顯減少。Realtime-PCR結果顯示，anti-IL-6 mAb組移植心臟中IL-17、IFN-γ和RORγt mRNA的轉錄水平較rat-IgG對照組及未治療組顯著下降，anti-IL-17 mAb輸注可部分下調IFN-

7、γ mRNA的轉錄水平。流式細胞儀檢測結果顯示anti-IL-6 mAb組受鼠脾臟CD4+及CD8+T細胞中IFN-γ的比例均有不同程度的下降，且CD4+IFN-γ+T細胞較CD8+IFN-γ+T細胞下降更為明顯，同時CD4+IL-17+T （Th17）細胞的比例在anti-IL-6 mAb組中亦明顯下降。
　　 結論：anti-IL-6 mAb可有效抑制急性排斥反應小鼠體內Th17和Th1細胞的活化，并延長同種異體心臟移植物的

8、存活時間。
　　 第三部分:
　　 目的：探討CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞在anti-IL-6 mAb抑制同種異體心臟移植急性排斥反應中的作用及機制。
　　 方法：以Balb/c和C57BL/6小鼠分別作為供受體，建立小鼠心臟移植急性排斥反應模型。實驗動物隨機分為anti-IL-6 mAb組、anti-IL-17 mAb組及rat-IgG對照組，流式細胞儀檢測各組受鼠移植術后第7天脾臟及移植心臟中C

9、D4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞的比例。分別于anti-IL-6 mAb組術后第1、3、5天給予anti-CD25 mAb輸注，于術后第7天取受鼠脾臟及移植心臟檢測CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞的比例，觀察移植心臟存活時間并結合組織學檢查；realtime-PCR檢測anti-CD25 mAb輸注后第3、7、10天移植心臟中IFN-γ mRNA的表達情況。使用去增殖的BALB/c 或C3H小鼠脾臟淋巴細胞作為刺激細胞

10、，各實驗組受鼠移植物來源的淋巴細胞作為反應細胞，行混合淋巴細胞培養(yǎng)檢測細胞增殖情況。
　　 結果：Anti-IL-6 mAb組移植術后第7天CD4+CD25+T細胞的比例明顯升高，CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞占CD3+T細胞的比例表現(xiàn)出同樣的趨勢，而anti-IL-17 mAb組與未治療組比較無明顯差異。Anti-CD25 mAb輸注anti-IL-6 mAb組明顯縮短了小鼠移植心臟的存活時間（10.6±1.2天）

11、，伴隨著CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞占CD3+T細胞的比例明顯下降，同時移植物中IFN-γ mRNA的轉錄水平升高。混合淋巴細胞培養(yǎng)結果顯示anti-IL-6 mAb組受鼠淋巴細胞經刺激后其細胞增殖程度較rat-IgG對照組、anti-IL-6 mAb+anti-CD25 mAb組及未治療組明顯下降，而針對來自第三方C3H小鼠的脾臟淋巴細胞刺激則無此抑制效應。
　　 結論：Anti-IL-6 mAb延長小鼠移植心臟