新Ⅰ型鴨肝炎病毒VP1和3D編碼基因的原核表達及抗3D蛋白單克隆抗體的制備.pdf

1、鴨病毒性肝炎(DVH)是一種由鴨肝炎病毒(DHV)引起的急性、高度致死性傳播迅速的傳染病,病死率高達100％,是鴨的五大傳染病之一,對養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴重危害。自從1945年在美國首次發(fā)現(xiàn)該病,其后世界多數(shù)國家相繼報道本病的流行。1994年,在韓國首次發(fā)現(xiàn)新型鴨肝炎病毒(DFIV-1C)。本試驗對DHV-1CN株的編碼結構蛋白的VP1基因和編碼非結構蛋白的3D基因進行原核表達,并通過Western-blot檢測其免疫活性,再利用純化后的重組原

2、核表達蛋白3D作為免疫原免疫小鼠,經過細胞融合,陽性篩選,雜交瘤細胞克隆化等步驟,成功制備1株抗DHV-1C的3D蛋白的單克隆抗體,為進一步對DHV-1C的VP1蛋白和3D蛋白的功能的研究和建立DHV-1C的快速診斷方法奠定了基礎,并同時建立用于篩選的間接ELISA方法。
　　 根據(jù)DHV-1C全基因序列,應用Primer5.0分析軟件設計合成了擴增DHV-1CN毒株的VP1和3D基因的兩對引物,在VP1基因引物中加入BamHⅠ

3、和XholⅠ酶切位點,在3D引物中加入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點,以DHV-1CN株RNA為模板,用這兩對特異性引物分別擴增VP1和3D基因,分別將VP1和3D基因克隆入pMD-18T中,經酶切后,將帶有酶切位點的片段克隆入pET-30a載體中,構建原核表達重組質粒BpET-30a-VP1-3和BpET-30a-3D-8,將其轉入宿主菌EcoliBL21(DE3)中誘導表達,SDS-PAGE和免疫印跡分析表明,重組原核表達蛋白VP1

4、和3D分別在誘導3h和4h后表達量達到最高,VP1表達產物大小約為37.68kDa,3D表達產物大小約為65.80kDa,Western-blot分析顯示二者都能與抗DHV-1C陽性血清產生特異性免疫反應,具有很好的免疫活性,可溶性分析顯示,二者均以不溶性的包涵體形式存在于菌體中。
　　 以純化的重組原核表達蛋白3D為免疫原腹腔皮下注射免疫BALB/c雌性小鼠,并作為包被抗原建立間接免疫酶聯(lián)吸附(ELISA)方法。在加強免后第三

5、天,取免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤SP2/0進行細胞融合,用已建立的間接EIASA方法篩選獲得1株分泌抗DHV-1C的3D蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞,命名為2D9。經亞型鑒定,2D9的亞型為IgG1亞類,輕鏈為K鏈。經Western-blot分析和間接ELISA檢測,2D9具有很好的特異性識別抗原能力,與番鴨呼腸孤病毒σB蛋白無交叉反應,特異性良好,經Dot-ELISA分析,2D9能夠識別天然構象蛋白,經免疫組化和免疫熒光檢測,2D9與感染