兔體外成骨細胞和脂肪細胞橫向分化的初步研究.pdf

1、目的:探討成骨細胞和脂肪細胞兩者間橫向分化的能力和方法,為進一步行縫隙連接通訊對其調(diào)控的實驗做準備。
　　 方法:選取3月齡新西蘭大白兔腹股溝處脂肪組織進行分離培養(yǎng)脂肪細胞,天花板貼壁法對脂肪細胞進行細胞去分化培養(yǎng),利用第3代去分化脂肪細胞進行成骨誘導(dǎo),并設(shè)立對照組進行對比。成骨分化指標的檢測:對培養(yǎng)3周后的兩組細胞進行Ⅰ型膠原免疫組化染色;使用BCIP/NBTALP顯色試劑盒對兩組細胞進行ALP染色;使用ALP活性檢測試劑盒分

2、別檢測各組第7天、第14天、第21天細胞的ALP活性;使用茜素紅對連續(xù)培養(yǎng)3周的兩組細胞進行鈣結(jié)節(jié)染色。取出生7天內(nèi)的乳兔顱骨進行成骨細胞的獲得及培養(yǎng),利用第3代成骨細胞細胞進行成脂誘導(dǎo),并設(shè)立對照組對比。脂肪細胞分化指標的檢測:兩組細胞培養(yǎng)3周后行油紅0染色:RT-PCR檢測兩組細胞PPARγmRNA的表達。
　　 結(jié)果:1、提取的成熟脂肪細胞經(jīng)天花板貼壁法培養(yǎng)后形態(tài)為長梭形成纖維細胞狀。2、成骨分化檢測:Ⅰ型膠原免疫組化染色

3、顯示實驗組細胞內(nèi)表達出Ⅰ型膠原,與對照組比較有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);ALP活性檢測試劑盒檢測各組細胞不同時段的ALP活性發(fā)現(xiàn)實驗組較對照組高(p＜0.05);且隨著培養(yǎng)時間的增長實驗組ALP活性逐漸增強(組內(nèi)p＜0.05),與對照組比較均有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);經(jīng)BCIP/NBTALP染色試劑盒檢測,實驗組細胞染色有棕黑色細微顆粒,多數(shù)分布在細胞膜上以及周圍,對照組細胞染色無棕黑色顆粒出現(xiàn):茜素紅對連續(xù)培養(yǎng)3周的兩組細胞進行

4、鈣結(jié)節(jié)染色發(fā)現(xiàn)實驗組有較多橘紅色結(jié)節(jié),而對照組無明顯發(fā)現(xiàn)。3、對提取的乳兔顱骨原代細胞茜素紅染色后證實提取的細胞為成骨細胞。4、成脂檢測指標:油紅0染色顯示實驗組細胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅染顆粒,對照組細胞未被紅染;RT-PCR檢測兩組細胞PPARγmRNA的表達,實驗組可見有PPARγmRNA表達,而對照組無PPARγmRNA的表達。
　　 結(jié)論:成熟脂肪細胞可以通過體外天花板培養(yǎng)實現(xiàn)去分化,去分化的脂肪細胞在成骨誘導(dǎo)環(huán)境下可以向成骨細