內毒素休克小鼠肝臟細胞質膜蛋白質組學研究.pdf

1、膿毒癥(sepsis)是感染引起的全身炎癥反應征候群，其嚴重并發(fā)癥--感染性休克(septic shock)是創(chuàng)傷、燒傷和手術后病人最主要的死亡原因之一。統(tǒng)計表明，臨床半數(shù)的膿毒癥是由于革蘭氏陰性菌(Gram-negative bacteria)感染引起的，革蘭氏陰性菌的細胞壁上的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，或稱為內毒素(endotoxin)，被認為是革蘭氏陰性菌引起膿毒癥的主要作用分子。LPS廣泛作用于機體

2、多種組織器官，其中內皮細胞、巨噬細胞和中性粒細胞是最主要的效應細胞。在LPS的刺激下，它們產生大量的細胞因子，即“細胞因子風暴”(cytokine storm)，進而引起失控性的炎癥級聯(lián)反應，最終引起內毒素休克、組織損傷和多器官功能障礙(mutiple organ dysfunction)。因此，膿毒癥或內毒素休克(endotoxic shock)的分子機制的研究大多集中在內皮、巨噬細胞和中性粒細胞上，而在其它組織和器官上的相對研究較少

3、。
　　 肝臟是人體代謝的樞紐，也是重要的免疫器官，血液中大量蛋白也是由肝臟合成分泌的。在膿毒癥的炎性應激刺激下，肝臟可以大量合成并分泌急性期蛋白(acute phase protein，AP)，如C-反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、α1-蛋白酶抑制劑(α1-proteinase inhibitor)、結合珠蛋白(haptoglobin)、纖維蛋白原(fibrinogen)及補體(complement)

4、等，可以啟動迅速的機體防御機制。然而肝臟對病原微生物或其毒性產物產生什么樣的反應?膿毒癥或感染性休克發(fā)生發(fā)展進程中肝臟自身變化如何?肝臟通過什么樣的分子調控機制調控多種炎癥相關反應蛋白的表達?對于這些問題，目前所知有限。然而，對這些問題的解答，對于了解錯綜復雜的膿毒癥及其感染性休克的發(fā)病機制無疑是有益的。
　　 LPS信號轉導通路的啟動是內毒素致病過程中的重要環(huán)節(jié)，而LPS與細胞膜上的受體相結合是其啟動細胞內信號反應的第一步。近

5、年來對LPS受體識別機制的研究取得了重要進展。發(fā)現(xiàn)LPS的受體并非單一受體。在LPS的跨膜信號轉導過程中，LPS與分化抗原-14(CD-14)結合后作用于細胞膜脂質雙分子層并激發(fā)多種生物活性分子，它們相互作用、聚集在一起形成LPS受體簇，共同完成LPS的跨膜信號轉導。其中包括Toll樣受體-4(Toll-like receptor4，TLR4)、髓樣分化蛋白-2(MD-2)、β2-整合素(CD11b/CD18)、分化抗原-55(CD55

6、)、分化抗原-81(CD81)、熱休克蛋白-70(heat shock protein70，HSP70)、熱休克蛋白-90(heat shock protein90，HSP90)、生長分化因子-5(growth-differentiationfactor5，GDF5)以及基質細胞衍生因子受體(chemokine receptor4，CXCR4)等。研究發(fā)現(xiàn)，在LPS刺激前，CD14、HSP70、HSP90就存在于細胞膜脂質層中，而TLR

7、4、CXCR4、GDF5僅在LPS刺激后才聚集在脂質層中。在LPS識別過程中，CD14的主要功能是催化LPS從細胞外空間轉運到膜上相關復合受體，TLR4-MD2復合物僅是LPS受體簇的一部分。并發(fā)現(xiàn)細胞脂質分子層的完整性不影響受體分子在細胞膜上的表達，但破壞脂質層的形成可以抑制LPS對細胞的活性作用，這些抑制作用可以直接歸因于脂質層破壞劑對LPS受體簇(HSP70、HSP90、CXCR4、GDF5、CD14和TLR4)的置換作用而非其它

8、的非特異性效應。另外，某些信號轉導分子如髓樣細胞分化因子等在LPS刺激后也募集到脂質雙分子層。由此可見細胞膜脂質層是信號轉導集中的區(qū)域。越來越多的研究資料表明，在LPS的識別及信號轉導過程中用單一受體模式來解釋太過簡單，在此過程中包含著多個受體在細胞超微結構區(qū)域的協(xié)同作用。同一類型細胞亦可存在多個跨膜受體參與LPS的信號轉導，LPS受體識別的信號級聯(lián)反應呈多樣性。多個不同受體分子或受體復合物在細胞膜脂質層上共同形成一個LPS受體簇，啟動

9、LPS信號轉導。細胞在受到LPS誘導刺激后，自身的機構和功能發(fā)生改變，并導致相應的合成和分泌功能發(fā)生變化。與正常細胞相比較，受刺激細胞表面許多分子的活性部位暴露，一些與病理相關的分子啟動表達或表達增高，提示受刺激的細胞與正常細胞表面存在著差異的分子，這些分子可能與內毒素休克的發(fā)生發(fā)展密切相關，因此，研究LPS刺激后的細胞膜脂質層中的蛋白質可能對LPS致病機制的認識具有推動作用。
　　 以往的研究大多是在已有的工作基礎上對少數(shù)幾個

10、細胞分子進行分析、在理論上推導出對疾病發(fā)生發(fā)展可能具有重要意義的分子，進而進行深入細致的功能研究。這是一種傳統(tǒng)的研究策略，其優(yōu)點是研究問題集中，容易深入，可以比較透徹地回答一個點上的問題，但是若將這個結果放到一個體系層面上，其功能又變得撲簌迷離，這是由“分析”主導的研究手段的局限所導致的，只有當這種“點”的結果積累得足夠多的時候，體系的問題也會變得逐漸清晰起來，但這個過程一般需要長時間的積累。隨著人類基因組計劃(human genomi

11、c project，HGP)的完成、蛋白質組學的理論系統(tǒng)和技術方法已成為后基因組時代的主旋律。這為我們從另一個角度，采用“綜合”的研究手段，用系統(tǒng)的觀點來研究問題提供了機遇。本課題在體系的角度上提出問題，擬應用蛋白質組學的方法進行研究。
　　 由于蛋白質組學研究具有大規(guī)模、高通量、高靈敏度的特點，因此可以有效分析細胞內的整體蛋白質。然而整個細胞或組織的蛋白組成極其復雜，直接對其進行蛋白質組學分析，往往會丟掉很多蛋白質信息，由此衍

12、生出了亞細胞蛋白質組學。亞細胞蛋白質組就是利用蛋白質組學研究技術來分析一種組織或細胞的某一亞細胞結構內的蛋白質組成，它一方面可以降低樣品的復雜度，使分析簡單化；另一方面可以相對富集相應亞細胞結構的低豐度蛋白，并且可以部分提示蛋白質的定位和功能信息。國外已有亞細胞蛋白質組方面的研究報道，并向縱深發(fā)展，出現(xiàn)了亞細胞器蛋白質組和復合體蛋白質組；但目前關于內毒素休克過程中肝臟細胞膜蛋白的亞細胞蛋白質組研究國內外未見報道。
　　 細胞質膜

13、作為細胞與外界進行物質、能量和信息交流的場所，在細胞的生命活動中起著至關重要的作用。膜蛋白行使著獨特的、聯(lián)系生物膜內外環(huán)境的功能，如細胞信號轉導、細胞問相互作用、細胞器在細胞內的區(qū)室化作用、離子和溶質的傳輸、能量產生等。因此膜蛋白被認為是細胞的“門鈴”與“門戶”，也是許多藥物的作用靶標。據(jù)估計，膜蛋白只占人類基因編碼蛋白質的20％～30％，但是在已經發(fā)現(xiàn)的藥靶中大約有70％是質膜蛋白質；而且最近一項統(tǒng)計表明僅作用靶點為1型或2型G蛋白受

14、體的藥物就占所有藥物的70％。
　　 根據(jù)上述思考，我們利用LPS來制作內毒素休克BALB/c小鼠模型，提取正常組和LPS刺激3 hr后的小鼠肝臟的細胞質膜蛋白來進行研究。我們采用差速離心結合蔗糖密度梯度離心提取和純化了正常對照組和LPS刺激后3 hr組小鼠肝臟的細胞膜，分別采用雙向熒光差異凝膠電泳(two-dimensional difference gelelectrophoresis，2D-DIGE)和二維高效液相色譜(t

15、wo dimensional high performanceliquid chromatograph，2D-HPLC)對兩組肝臟細胞膜蛋白進行分離，并建立了相應的差異蛋白圖譜。
　　 根據(jù)2D-DIGE的差異圖譜，在LPS刺激3 hr組和正常對照組間我們找到了19個差異蛋白點，其中上調的有13個，下調的有6個。在二維高效液相色譜的差異圖譜中，找到了24個差異點，其中上調的有16個，下調的有8個。將上述差異蛋白點取出，進行質譜(

16、mass spectrum，MS)酶解樣品制備，使用ABI4800MALDI TOF/TOF質譜儀進行分析。通過mascot軟件檢索SWISSPROT數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白。去除角蛋白的污染及鑒定相同的蛋白后，共鑒定出33個蛋白。通過2D-DIGE分離得到的差異蛋白中，LPS刺激3hr組與正常組比較，表達上調的蛋白有：琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase)，白蛋白(serum albumin)，ATP合酶α亞基(ATP

17、symhase subunitα)，細胞色素還原酶亞基1(cytochrome b-clcomplex subunit1)，丙酮酸羧化酶(pyruate carboxylase)，熱休克蛋白70(heatshock protein70 kDa protein1B)，harmartin，副清蛋白α(paralbumin alpha)，視黃醇脫氫酶11(retinol dehydrogenase11)，皮質激素2(cortexin-2)，醛

18、脫氫酶(aldehyde dehydrogenase)，共11個蛋白；表達下調的蛋白：谷氨酸脫氫酶1(glutamate dehydrogenase1)，danJ homolog subfamily C member13，proteinKIAA024826，共3個蛋白。通過PF2D得到的差異蛋白中，LPS刺激3 hr組與正常組相比，表達上調的蛋白有：多凝血因子缺乏蛋白2(multiple coagulationfactor defici

19、ency protein2)，細胞色素b5(cytochrome b5)，線粒體輸入內膜轉運酶亞基(mitochondrial import inner membrane translocase subunit TimB13)，細胞色素c氧化酶亞基4異構體1(cytochrome c oxidase subunit4 isoform1)，ATP合酶α亞基(ATP synthase subunit alpha)，白介素23受體(IL-23

20、 receptor)，ETS相關轉錄因子1(ETS-related transcription factor EIf-1)，血清淀粉樣蛋白A1(serum amyloid A1)，細胞色素c還原酶亞基7(cytochrome b-cl complex subunit7)，pumilio homolog1，protein S100A9，細胞色素c氧化酶VIb亞基異構體1(cytocllrome c oxidase subunit VIb

21、isoform1)，latrophlin-2，促腎上腺皮質激素受體(adrenocorticotropic hormone receptor)和culin-4A等15個蛋白；表達下調的蛋白有轉位相關蛋白δ亞基(translocon-associated protein subunit delta)，主要尿蛋白11和8(major urinary proteins11 and8)，組蛋白H4(histone H4)，組蛋白H2A1H型(h

22、istone H2Atype1-H)，組蛋白H2A1F型(histone H2Atype1-F)，胰島素樣生長因子結合蛋白5(insulin-like growth factor-binding protein5)等6個蛋白。兩種分離方法鑒定出相同的蛋白只有2個，分別是ATP合酶α亞基(ATPsynthase subunit alpha)和細胞色素c還原酶亞基(cytochrome b-cl complexsubunit)。
　　

23、 對鑒定出的所有33個差異蛋白進行生物信息學的功能分析，分別從蛋白質表達的細胞內位置、分子功能、生物學過程以及代謝和轉導通路上進行分析。通過定位分析發(fā)現(xiàn)完全定位于細胞質膜上的有3個；既可定位于細胞質膜上，又可以定位于其它多個亞細胞結構的有7個；預測只在其它亞細胞結構定位，但是沒有定位于細胞質膜上的有23個。通過定位預測分析后，我們又對蛋白質進行功能分析，利用蛋白質數(shù)據(jù)庫的GO(gene ontology)進行功能注釋、蛋白質結構域(d

24、omain)和模體(motif)的分析，發(fā)現(xiàn)細胞質膜差異表達蛋白質涉及分子伴侶、轉運蛋白、受體、氧化還原酶、轉移酶、鈣離子結合、核苷酸結合蛋白、抑癌基因等功能。
　　 應用RT-PCR技術對正常組和LPS刺激3 hr組小鼠肝組織中S100A9蛋白的mRNA進行驗證，結果發(fā)現(xiàn)S100A9的mRNA在LPS刺激3 hr組中表達上調，與通過PF2D篩選的結果一致。
　　 通過研究，我們得到以下結論：
　　 1.應用透射

25、電子顯微鏡及蛋白免疫印跡兩種方法分別檢測所提取的細胞質膜的形態(tài)及純度，表明差速離心結合蔗糖密度梯度離心法是提取肝組織細胞質膜的有效方法。
　　 2.運用2D-DIGE和PF2D兩種分離技術分離了正常和內毒素休克BALB/c小鼠(LPS3 hr)的肝臟細胞質膜蛋白，并建立了相應的差異蛋白圖譜。通過相應的軟件分析，通過2D-DIGE分離得到了19個具有統(tǒng)計學意義的差異蛋白點，通過PF2D分離得到了24個差異蛋白組分。
　　

26、3.對19個差異蛋白點和24個差異蛋白組分進行質譜鑒定，去除角蛋白污染峰后，共鑒定出33個蛋白；通過兩種分離方法共同獲得的蛋白只有2個，分別是ATP合酶α亞基(ATP synthase subunit alpha)和細胞色素c還原酶亞基(cytochrome b-cl complex subunit)。
　　 4.對33個差異蛋白進行亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)完全定位于細胞質膜上的有3個，既可定位于細胞質膜上，又可以定位于其它多個亞細胞結