金屬硫蛋白在原核生物中的表達(dá)及在環(huán)境治理中的應(yīng)用.pdf

1、金屬硫蛋白是一類富含半胱氨酸的低分子量，金屬結(jié)合蛋白。廣泛存在于從細(xì)菌到哺乳動(dòng)物的多種生物體內(nèi)。金屬硫蛋白與重金屬解毒有關(guān)，并且參與真核生物體內(nèi)許多微量金屬元素的代謝。金屬硫蛋白的主要特征之一是富含半胱氨酸，約占氨基酸總數(shù)的1/3，但是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中并沒有二硫鍵。金屬硫蛋白的特殊結(jié)構(gòu)及其重要的生理作用，引起許多科學(xué)家的研究興趣。據(jù)報(bào)道，在已知各種金屬硫蛋白中，人類的金屬硫蛋白的解毒能力最強(qiáng)，并且能安全的應(yīng)用于藥物，食品，化妝品中。

2、 這篇論文選取人肝金屬硫蛋白-Ⅰ A進(jìn)行研究。在大腸桿菌中表達(dá)人類金屬硫蛋白，并研究蛋白質(zhì)的性質(zhì)和應(yīng)用。與其它真核生物的基因相比較，金屬硫蛋自在大腸桿菌中表達(dá)量很低，目前仍然不知道其原因。傳統(tǒng)的金屬硫蛋白的生產(chǎn)是從經(jīng)過重金屬誘導(dǎo)的哺乳動(dòng)物的肝臟中提取的，這種方法成本昂貴并且產(chǎn)量很低。在本研究中，通過用原核生物大腸桿菌工程菌表達(dá)金屬硫蛋白，從而降低其生產(chǎn)成本，并且研究了工程菌在生物吸附中的作用。 本文采用化學(xué)法合成人肝金屬硫蛋白Ⅰ

3、 A的基因。首先根據(jù)Genbank中報(bào)道的人肝金屬硫蛋白_Ⅰ A的氨基酸序列，并根據(jù)大腸桿菌對(duì)密碼子的偏好性設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)基因序列，然后根據(jù)載體上的多克隆位點(diǎn)在合成基因的兩端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)，C端為Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ，N 端為：BamH Ⅰ。為了便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的蛋白質(zhì)分析純化，在C端添加了含六個(gè)組氨酸的His-tag。 由于金屬硫蛋白容易被原核生物中的蛋白水解酶分解，所以經(jīng)常將金屬硫蛋白以融合蛋白的形式表達(dá)以增加它的穩(wěn)定性同時(shí)還要確

4、保蛋白的結(jié)構(gòu)和功能不受融合蛋白標(biāo)簽的影響。經(jīng)常與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶或者β-半乳糖苷酶融合表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中選用pGEX-4T-1作為表達(dá)載體，通過酶切連接將合成基因插入到表達(dá)載體中，構(gòu)建金屬硫蛋白表達(dá)質(zhì)粒pGHM，將其轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21和JM109中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白質(zhì)印跡分析檢測(cè)，證實(shí)在構(gòu)建的工程菌株中有金屬硫蛋白的表達(dá)。 通過對(duì)所構(gòu)建的工程菌對(duì)砷的吸附量，吸附時(shí)間的檢測(cè)及pH值，誘導(dǎo)物，砷濃度