藤茶中抗氧化活性物質(zhì)的提取及其二氫楊梅素生理活性分析.pdf

1、藤茶系我國南方特有茶、藥兩用植物，富含二氫楊梅素等黃酮類化合物，具有顯著的抗氧化、抗腫瘤和降血脂活性，值得深入研究。本文建立五個抗氧化活性評價指標，用以評價響應面設計法優(yōu)化的藤茶中抗氧化活性物質(zhì)的超聲強化提取工藝，并采用超聲輔助雙水相提取方法優(yōu)化藤茶中指標性成分——二氫楊梅素的提取工藝;系統(tǒng)分析了二氫楊梅素體內(nèi)外抗氧化及抑制腫瘤細胞增殖活性，并探討了過渡金屬Cu2+在二氫楊梅素抑制肝癌細胞HepG2增殖中的作用:二氫楊梅素-Cu2+體系

2、的促氧化活性是誘導HepG2細胞凋亡的主要機制。研究結(jié)果為藤茶在食品、醫(yī)藥領域中的應用提供了理論依據(jù)。主要研究內(nèi)容如下:
　　(1)藤茶中抗氧化活性物質(zhì)的提取以總多酚、二氫楊梅素得率，F(xiàn)e2+、Trolox當量為指標，通過單因素及響應面設計法，確定了對抗氧化活性指標影響顯著的三個因素（乙醇質(zhì)量分數(shù)、超聲提取溫度和提取時間），建立了抗氧化指標與三個因素間的數(shù)學模型，并得出藤茶中抗氧化活性物質(zhì)的最佳提取工藝參數(shù)為:乙醇質(zhì)量分數(shù)67％～

3、68％，超聲提取溫度45～48℃，時間27～28min，料液比25mL·g-1。在此優(yōu)化工藝下藤茶多酚得率為358.4±4.9mg·g-1，二氫楊梅素得率315.6±6.2mg·g-1，F(xiàn)e2+當量為570.6±7.8μmol·g-1，Trolox當量為14.9±0.55mmol·g-1(ABTS法)和12.1±0.68mmol·g-1(DPPH法)。
　　(2)藤茶中二氫楊梅素的雙水相提取及富集建立硫酸銨-乙醇雙水相超聲輔助提取

4、體系用于藤茶中二氫楊梅素的提取。通過單因素試驗及響應面分析法，得出二氫楊梅素的最佳提取工藝參數(shù)為:硫酸銨質(zhì)量分數(shù)26.96％，乙醇質(zhì)量分數(shù)21.84％，提取溫度51℃，二氫楊梅素得率為360.4±5.8mg·g-1;硫酸銨質(zhì)量分數(shù)27.30％，乙醇質(zhì)量分數(shù)23.08％，提取溫度50℃，二氫楊梅素在兩相間的分配系數(shù)為18.9±1.1。首次嘗試制備富氮多孔磁性納米材料N-g-C3N4-MnFe2O4用于雙水相下相殘留二氫楊梅素的富集，獲得了

5、初步富集工藝:在初始二氫楊梅素濃度20μg·g-1，pH5.5，硫酸銨質(zhì)量分數(shù)4.0％，萃取溫度為25℃條件下，N-g-C3N4-MnFe2O4對二氫楊梅素吸附量可達到5.36mg·g-1，通過一次萃取，可富集75.4％的二氫楊梅素，顯現(xiàn)了一定的應用價值。
　　(3)二氫楊梅素體內(nèi)外抗氧化活性分析采用體外試驗方法，對二氫楊梅素在生理性羥基、亞硝基和超氧陰離子自由基清除，非生理性DPPH、ABTS·+、DMPD·+自由基清除，總抗氧

6、化能力、還原能力以及對過渡金屬離子還原、螯合等方面的抗氧化活性進行了系統(tǒng)研究。結(jié)果顯示:二氫楊梅素具有很強的抗氧化活性，并呈現(xiàn)良好的劑量效應關系，其抗氧化能力相當或略低于陽性對照Vc，但對金屬離子的螯合能力較弱。采用D-半乳糖所致小鼠衰老模型，分析了二氫楊梅素對衰老模小鼠體內(nèi)各抗氧化活性酶表達水平的影響。結(jié)果顯示:二氫楊梅素能夠劑量依賴性地提高衰老小鼠各臟器指數(shù)，提高衰老小鼠體內(nèi)各抗氧化酶表達水平，降低脂質(zhì)過氧化水平。
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7、二氫楊梅素體外抗腫瘤活性研究了二氫楊梅素對腫瘤細胞的增殖抑制活性，結(jié)果顯示:二氫楊梅素對結(jié)腸癌HCT116和肝癌HepG2兩種腫瘤細胞的抑制活性較強，對肺癌A549細胞抑制活性較弱。二氫楊梅素對HepG2腫瘤細胞呈現(xiàn)劑量-時間-依賴性抑制活性，Cu2+能夠增強二氫楊梅素的抗HepG2活性。進一步采用Hoechst33342染色、AnnexinⅤ/PI雙染色、DCFH-DA探針、Western Blot等方法對二氫楊梅素作用后的HepG2

8、腫瘤細胞進行了細胞形態(tài)、細胞凋亡、細胞周期、細胞內(nèi)ROS水平及凋亡蛋白表達等的分析。結(jié)果顯示，二氫楊梅素-Cu2+體系促氧化作用產(chǎn)生的活性氧能經(jīng)由線粒體途徑誘導HepG2細胞凋亡。建立了二氫楊梅素-Cu2+體系體外促氧化活性分析方法，揭示了在酸性條件下二氫楊梅素更容易將Cu2+還原為Cu+，進而產(chǎn)生羥基自由基將DNA和蛋白質(zhì)氧化。
　　實驗結(jié)果對于揭示二氫楊梅素促氧化活性抗腫瘤作用機制以及開發(fā)研制新型高效、低毒的抗腫瘤保健食品與藥