熱休克預適應促進骨髓來源Sca-1+干細胞存活的實驗研究.pdf

1、心肌梗死已成為危害老年人身體健康的主要疾病之一。目前藥物治療(抗凝、溶栓)、冠狀動脈介入治療和冠狀動脈旁路搭橋雖能改善癥狀,使閉塞血管再通,卻不能再生心肌。近年來的研究發(fā)現(xiàn),人體存在多器官來源的干細胞,這些干細胞具有多向分化潛能,可以直接定向分化為成熟心肌或間接促建心肌細胞再生。目前胚胎干細胞、骨髓間充質干細胞、骨骼肌衛(wèi)星細胞、心肌干細胞以及最近發(fā)現(xiàn)的誘導多能干細胞等多種細胞,已被用于體外實驗和缺血性心肌病動物模型的研究。隨著干細胞技術

2、的出現(xiàn)和成熟,人們在這一領域取得了前所未有的進步。干細胞移植為病損心肌的重建和功能恢復提供了一種全新的治療策略。
　　 然而,兩大問題困擾著干細胞從基礎到臨床的轉化:(1)如何提高干細胞向心肌細胞分化的誘導效率?(2)如何提高干細胞在移植后梗死心肌的存活率?本課題圍繞第二個問題展開研究。
　　 干細胞能夠向心肌細胞分化,具有修復心肌組織的潛能。一般認為,干細胞執(zhí)行心臟修復的功能,需要一定數(shù)量的具有活性的干細胞作為基礎。但

3、是移植后的存活率極低。一些研究報道骨骼肌成肌細胞70-80％在移植后3天內死亡,而另一些研究組報道的死亡率更高,2天內死亡率達93％。有文獻報道,在自身免疫缺陷小鼠模型中,移植間充質細胞4天后僅有少于0.44％細胞存活；而采用冠脈注射法對大鼠移植干細胞,4周后僅余0.55％的干細胞存活?？梢?在進行了MSCs移植后,可發(fā)生大量的細胞損失(cell lose)。MSCs移植的治療效果與細胞在移植入心肌的原位存活率密切相關,只有具備長期存活

4、力的干細胞,才能夠向心肌細胞分化,執(zhí)行心肌修復的能力。因此,細胞的大量丟失在極大程度上限制了干細胞移植的效果,這一觀點不僅有大量的動物實驗支持,同時得到了許多臨床試驗的驗證。低氧是細胞損失的重要因素,低氧通過造成大量的細胞損失在極大程度上限制了干細胞移植。在體內環(huán)境中,低氧與血清剝奪共同發(fā)揮作用,誘導細胞凋亡。也是本研究使用糖氧剝奪模型誘導細胞死亡的理論基礎。
　　 為了提高干細胞移植后的存活率,國內外學者采取了各種各樣的努力,

5、并發(fā)展了許多有效的策略,比如Bcl-2或Akt,GSk-3D基因修飾的MSCs對心肌梗死大鼠進行治療,發(fā)現(xiàn)存活率,血管密度以及大鼠心臟功能的恢復得到改善。然而基因轉染可能會導致免疫排斥,癌變等問題。那么是否存在單純物理方法就能提高干細胞的心肌存活率?既往有報道熱休克能促進神經(jīng)元存活,但對干細胞的保護效應國內外至今未見報道。因此,本課題將圍繞熱休克對干細胞的效應進行研究:(1)熱休克能否促進干細胞存活?(2)若能促進存活,其中起關鍵作用的

6、分子伴侶是什么?其調控機制是什么?(3)該分子伴侶的靶標是什么?回答這些問題,以期解決干細胞移植治療心肌梗死的部分關鍵問題。
　　 [實驗結果]
　　 1.熱休克顯著促進熱休克蛋白70(Hsp70)上調:將骨髓來源的Sca-1細胞種植在培養(yǎng)皿24小時后行熱休克處理(42℃,0.5％CO2),時間分別為15min,30min,1 h,2h,3h。而非熱休克細胞(control,CL)則在37℃,0.5％CO2環(huán)境中放置3h

7、。處理結束后收集蛋白,用免疫印跡檢測Hsp20、Hsp27、Hsp70、Hsp90蛋白表達水平。發(fā)現(xiàn),Hsp20、Hsp27、Hsp90表達沒有變化而Hsp70在熱休克2h后上調,3h后達峰值。
　　 HSP70是亞基分子量為70KD,考慮其到分子量較大,我們猜想其合成需一定時間,故我們探討了熱休克后不同的孵育時間對Hsp70表達的影響。結果讓我們驚奇,我們發(fā)現(xiàn)熱休克14 h后Hsp70顯著上調(熱休克處理3h組較非熱休克組上調

8、達14倍),并持續(xù)到24h。
　　 2.熱休克促進干細胞在糖氧剝奪模型中的存活,保護效應由Hsp70介導:將熱休克處理并孵育14小時的細胞進行糖氧剝奪處理(Oxigen GlucoseDeprivation,OGD),通過LDH及TUNEL動態(tài)觀察細胞死亡變化,發(fā)現(xiàn)OGD后8h,非熱休克處理組細胞死亡顯著增加(～40％),而HS-3h組細胞死亡減少(～20％)。隨后我們用流式細胞術行 Annexin-Ⅴ檢測,進一步確認了這一變化

9、。充分說明熱休克能促進干細胞存活。當用小分子干擾RNA敲低Hsp70表達后,熱休克的保護效應顯著降低,說明Hsp70為介導熱休克促進干細胞存活的關鍵分子。
　　 3.Akt促進HSF1向細胞核轉位:熱休克顯著促進Hsp70上調,那么上調的機理是什么?我們在同一張膜上檢測了兩個常見的影響細胞存活信號分子Akt和ERK的磷酸化情況,發(fā)現(xiàn)Hsp70上調的同時Akt的磷酸化(ser-473)顯著增強而ERK沒有變化。而在行熱休克前加入P

10、I3K抑制劑LY294002(40μM)能顯著抑制熱休克誘導的Hsp70表達(與ERK抑制劑組和DMGO組相比)。因而確定Akt為調控Hsp70誘導表達的關鍵分子。
　　 大量的研究報道在被熱刺激所激活后,在細胞漿中的熱休克因子1(HeatShock Factor1,HSF1)進入細胞核,與Hsp70的啟動子結合,直接促進Hsp70轉錄。我們因而猜想Akt是否通過促進HSF1轉位而誘導Hsp70表達?WesternBlot結果顯

11、示,熱休克前胞漿HSF1高度富集而細胞核含量較少,熱休克后卻恰恰相反,胞漿HSF1含量顯著減少而細胞核內高度富集,而同時公認的HSF1抑制物GSK-3β的活化受到抑制。而當加入PI3K抑制劑LY294002(40μM)時,HS目的這種轉位被顯著抑制。而同時GSK-3β的抑制物重新活化。因而Akt通過抑制GSK-3β進而促進HSF1向細胞核轉位。
　　 4.miR-34a為靶向Hsp70的microRNA:除了HSF1直接激活Hs

12、p70引起Hsp70上調外,那么是否存在轉錄水平以外機制導致Hsp70表達上調?近年來發(fā)現(xiàn)microRNA在轉錄后水平影響蛋白翻譯,進而減少蛋白合成。生物信息學的分析預測miR-34a可能是靶向Hsp70的microRNA,我們其后展開了miR-34a與Hsp70的靶標確認工作。包括:gain-of-function,loss-of-function以及報告基因熒光素酶活性檢測。Gain-of-function的結果發(fā)現(xiàn)轉染miR-34

13、a mimic(模擬物),Hsp70蛋白表達較negative control和native(不轉染)顯著下調。而loss-of-function顯示轉染miR-34a鎖核苷酸抑制劑(LNA inhibitor)Hsp70表達較negative control和native(不轉染)相比Hsp70蛋白表達顯著上調。Gain-of-function和loss—of-function的結果強烈提示miR-34a為調控Hsp70的microR

14、NA,但Hsp70是否為miR-34a的直接靶標尚需熒光素酶報告基因驗證。于是我們構建了Hsp703'UTR熒光素酶報告基因載體并分別將miR-34a mimic及陰性對照miR negative control與Hsp703'UTR熒光素酶報告基因載體共轉染,48小時后裂解細胞并檢測熒光強度。結果顯示,Hsp703'UTR luciferase reporter+miR-34a mimic組的熒光表達強度相對與對照組顯著降低,說明mi

15、R-34a對Hsp70的3’UTR有較強的結合作用,能抑制螢火蟲熒光素酶的表達。miR-34a為直接靶向Hsp70的microRNA。
　　 5.HSF1能抑制miR-34a表達,間接促進Hsp70上調:既然miR-34a能抑制Hsp70的表達。一個很自然想到的問題是其在熱休克模型中的內源性表達情況如何?我們通過Q-PCR檢測發(fā)現(xiàn),行熱休克處理后miR-34a顯著下調達70％。那么miR-34a下調的原因是什么?而現(xiàn)今認為DNA

16、甲基化和組蛋白修飾是導致microRNA下調的重要原因。而我們用重亞硫酸鹽檢測方法檢測DNA甲基化,發(fā)現(xiàn)熱休克后miR-34a啟動子上DNA甲基化未發(fā)生顯著改變,而染色質免疫共沉淀(ChIP)結果則顯示染色質打開的一個重要標記組蛋白H3賴氨酸4三甲基化(H3K4me3)在miR-34a啟動子上的修飾明顯減少,而染色質關閉的一個重要標記組蛋白H3賴氨酸27三甲基化(H3K27me3)在miR-34a啟動子上的修飾明顯增強,而同時啟動miR

17、-34a轉錄的RNA聚合酶Ⅱ在miR-34a啟動子上的富集顯著減少。說明組蛋白修飾,尤其是H3K27me3修飾增強是導致miR-34a下調的重要原因。而既往研究表明H3K27me3修飾增強是由于轉錄因子結合在啟動子上招募一系列表觀調控因子導致這一修飾改變。那么miR-34a究竟結合了什么轉錄因子抑制了其轉錄?
　　 有趣的是,我們通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)miR-34a啟動子上存在HSF1結合位點。我們立即進行ChIP實驗,確認了m

18、iR-34a啟動子上的確存在HSF1結合,且熱休克后HSF1在miR-34a啟動子的富集顯著增強。之后,我們用小分子干擾RNA敲低HSF1表達時發(fā)現(xiàn)miR-34a能顯著上調。以上實驗說明HSF1很可能通過在miR-34a啟動子上富集,引起抑制H3K27me3修飾增強,使maR-34a啟動子周圍的染色質關閉,轉錄下調,從而引起miR-34a表達降低。
　　 6.細胞色素C氧化酶亞單位4(Cox-Ⅳ)為新發(fā)現(xiàn)的Hsp70結合蛋白:盡

19、管發(fā)現(xiàn)了Hsp70為介導熱休克效應的關鍵分子,但Hsp70作為分子伴侶,其最終的功能是要確保蛋白在應激情況下正確折疊或免遭降解。那么在我們確立的對干細胞有保護效應的熱休克模型中,Hsp70要保護的蛋白是什么?
　　 首先利用蛋白組學技術尋求與Hsp70相互作用蛋白,試圖回答這一問題。我們的策略是首先進行免疫共沉淀,把跟Hsp70結合的蛋白盡可能pull down下來,然后進行質譜鑒定。實驗準備了兩組細胞,一組細胞給予熱休克刺激(

20、HS3h-incu14h),另一組細胞不給予熱休克刺激(HSOh-incu14h),然后兩組細胞均給予亞致死量刺激(OGD4h)后收集蛋白,進行免疫共沉淀(抗Hsp70抗體沉淀)。然后對產(chǎn)物進行還原,烷基化,胰蛋白酶消化后進行高效液相色譜二級串聯(lián)質譜分析(LC-MS/MS),并對肽序列進行測序鑒定。所鑒定的肽序列中,有2段跟Cox-Ⅳ完全匹配。而免疫熒光發(fā)現(xiàn)Cox-Ⅳ與Hsp70存在共定位現(xiàn)象。生物信息學預測也發(fā)現(xiàn)Hsp70存在兩個高度

21、同源的結構域,提示Cox-Ⅳ可能為新發(fā)現(xiàn)的Hsp70結合蛋白。最后,我們再次進行免疫共沉淀實驗(抗Hsp70抗體),發(fā)現(xiàn)Hsp70抗體能有效捕獲Hsp70,而normal IgG卻不能捕獲Hsp70,說明了我們進行免疫共沉淀的抗體具有特異性。并且在熱休克組中,利用抗Hsp70的抗體pull down下來的產(chǎn)物能同時檢測到Cox-Ⅳ,而在非熱休克處理組中不存在(結果與質譜分析結果一致)。這些結果充分說明Cox-Ⅳ為新發(fā)現(xiàn)的Hsp70結合蛋

22、白。
　　 那么Hsp70對Cox-Ⅳ是否有保護作用?我們首先檢測了OGD4h后熱休克組和非熱休克組的表達情況。發(fā)現(xiàn)熱休克組Cox-Ⅳ組表達顯著較非熱休克組上調。而敲低Hsp70表達能下調Cox-Ⅳ的表達。說明Hsp70對Cox-Ⅳ能調控Cox-Ⅳ表達。
　　 [結論]
　　 1.熱休克促進骨髓來源Sca-1干細胞存活；
　　 2.熱休克的保護效應通過上調Hsp70介導;
　　 3.miR-34a