豬Myostatin基因RNA干擾及啟動(dòng)子研究.pdf

1、肌肉生長(zhǎng)抑制素(MSTN),是TGF-β超家族成員,是肌肉細(xì)胞的自分泌因子,主要在動(dòng)物骨骼肌中特異性表達(dá)并對(duì)肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育起到負(fù)調(diào)控作用。該基因敲除的小鼠,其骨骼肌重量增加到正常小鼠的兩倍左右。RNA干擾(RNAi)是一種特異性降解靶基因mRNA序列的基因表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制,具有高效、特異、快速等優(yōu)點(diǎn),已成為研究基因功能和表達(dá)調(diào)控的有效方法。因此,本實(shí)驗(yàn)利用PCR方法以豬骨骼肌cDNA為模板克隆Myostatin基岡并構(gòu)建真核表達(dá)載體pMST

2、N-1;針對(duì)豬肌生成抑制素基因mRNA3個(gè)干涉位點(diǎn),設(shè)計(jì)合成三對(duì)特異的shRNA干擾序列和一對(duì)非特異的shRNA干擾序列,通過(guò)退火形成雙鏈后依次將其連入帶有U6啟動(dòng)子的干涉載體pGenesil-1上,構(gòu)建干擾載體。得到含四個(gè)目的DNA片段的重組質(zhì)粒分別脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)Myostatin細(xì)胞,利用realtime-PCR檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中Myostatin在mRNA水平的表達(dá),檢測(cè)干擾效果。結(jié)果表明3個(gè)干擾片段均在一定程度上下調(diào)了MSTN

3、mRNA的表達(dá)。shRNA1、shRNA2和shRNA3對(duì)MSTN基因的抑制率分別為69.82％、80.97％和87.52％,同時(shí)轉(zhuǎn)染shRNA0也能抑制MSTN基因的表達(dá)但是差異不顯著,3對(duì)干擾序列間干擾水平無(wú)明顯差異。
　　 同時(shí)本研究中,對(duì)Myostatin基因啟動(dòng)子功能進(jìn)行了研究。利用PCR方法從豬基因組DNA中分離了1.2kb的Myostatin基因啟動(dòng)子(Pro)序列。該啟動(dòng)子序列與已報(bào)道的GenBank序列:AJ1

4、33580和AY527153相應(yīng)序列的相似度分別為100％和99.5％,進(jìn)一步以GFP為報(bào)告基因,構(gòu)建真核表達(dá)載體MSTNPro-EGFP:通過(guò)轉(zhuǎn)染C2C12小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞系和豬成纖維細(xì)胞,對(duì)豬Myostatin基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)成功克隆了豬Myostatin基因啟動(dòng)子,并且構(gòu)建了真核表達(dá)載體,豬Myostatin基因啟動(dòng)子可以啟動(dòng)GFP在C2C12細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),而將豬MSTNProEGFP載體