降鈣素基因相關(guān)肽對未成熟肺氧化應(yīng)激性損傷的保護作用及其Wnt7b-β-catenin信號機制.pdf

1、第一部分:不同濃度及時間氧暴露對未成熟鼠肺發(fā)育的影響
　　目的:研究不同濃度及時間氧暴露后早產(chǎn)鼠肺組織病理學(xué)、肺泡化程度及胎鼠原代AECII存活的情況，了解不同氧濃度及其作用時間對未成熟肺發(fā)育的影響。
　　方法:孕21 d SD早產(chǎn)鼠21％(空氣)、40％、60％、95％梯度濃度氧暴露不同時點光鏡觀察未成熟肺組織病理變化及肺泡化程度、酶標儀測定肺組織MDA含量及TAOC；原代培養(yǎng)的SD胎鼠AECII制備上述梯度濃度氧細胞模型

2、，Annexin V/PI雙標記法檢測細胞死亡，MTT法評估AECII增殖，流式細胞儀測定細胞內(nèi)ROS水平，酶標儀檢測細胞TAOC。
　　結(jié)果:動物實驗發(fā)現(xiàn)40％氧暴露后3 d、7 d、14 d早產(chǎn)鼠體質(zhì)量及體質(zhì)量增長、存活率與空氣(常氧)對照組比較無顯著性差異，60％氧暴露組3 d、7 d、14 d各時點體質(zhì)量及體質(zhì)量增長、存活率均明顯低于同時點空氣對照組(p<0.05)，95％氧暴露組體質(zhì)量及體質(zhì)量增長、存活率降低程度更為顯著

3、(p<0.01)；光鏡下觀察空氣對照組及40％氧暴露組3 d、7 d、14 d肺組織未見病理改變，結(jié)構(gòu)清楚，肺泡大小均一，無炎性滲出，RAC值逐漸升高，60％氧暴露后7 d可見肺內(nèi)小血管充血，少量炎性改變，14 d時肺泡腔有所擴張且RAC值與空氣對照組比較明顯降低(p<0.01)，95％氧暴露3 d即有肺小血管擴張充血、炎性浸潤，7 d時肺部炎癥更為明顯，14 d炎癥減輕，但肺泡結(jié)構(gòu)簡單化，7 d、14 d RAC值與同時點空氣對照組比

4、較明顯減少(p<0.01)；40％氧暴露組及空氣對照組肺組織MDA含量隨暴露時間延長沒有明顯變化，兩組間同時點MDA含量及TAOC無顯著差異，60％氧暴露組MDA含量7 d、14 d時增多，同時TAOC降低，與同時點空氣對照組比較有顯著性差異(p<0.01)，95％氧暴露后3 d、7 d、14 d肺組織MDA含量升高，TAOC降低，與空氣對照組比較有顯著性差異(p<0.01)。體外細胞實驗中觀察到空氣對照組即常氧條件下培養(yǎng)24 h內(nèi)的A

5、ECII呈立方生長良好，AECII特有結(jié)構(gòu)板層小體較多，48 h后細胞中可見板層小體排出留下的空泡，72 h細胞生長不良，胞漿中空泡增多，板層小體顆?；鞠?，40％氧暴露組AECII體外培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、48 h、72h細胞形態(tài)學(xué)改變與空氣對照組相似，60％氧暴露24 h AECII呈現(xiàn)生長不良狀態(tài)，48 h胞漿中出現(xiàn)空泡，72 h后細胞變形，空泡增多，95％氧暴露6 h后即可觀察到AECII細胞間隙增寬，細胞連接松散，

6、板層小體顆粒減少，12-24 h后胞漿中空泡明顯增多，細胞核腫脹，48-72 h細胞腫脹，喪失正常形態(tài)結(jié)構(gòu)；Annexin V/PI雙標記法流式細胞學(xué)檢測結(jié)果顯示，40％氧暴露后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h早期凋亡細胞數(shù)及晚期凋亡、壞死細胞數(shù)與空氣對照組比較均無明顯差異，兩組細胞在干預(yù)后72 h早期凋亡細胞數(shù)均有所增加，與同組前一時點比較差別具統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)，60％氧暴露后24 h發(fā)生早期凋亡及晚期凋亡、壞

7、死的細胞均增加，48 h、72 h死亡細胞數(shù)更多，與同時點空氣對照組相比差異具有顯著性(p<0.05)，95％氧暴露后6h、12 h、24 h、48 h、72 h隨高氧暴露時間延長，發(fā)生死亡的細胞越多，較同時點空氣對照組具顯著性差異(p<0.05)，死亡細胞數(shù)較之60％氧暴露組亦明顯增高(p<0.05)；MTT結(jié)果顯示，與同時點空氣對照組相比，40％氧暴露6 h、12 h、24 h、48 h、72 h增殖活性無顯著變化，兩組細胞增殖均于

8、24 h達高峰，48 h有所減緩，72 h反而降低，與同時點空氣對照組比較，60％氧暴露24 h、48 h、72 h及95％氧暴露后6 h、12 h、24 h，48 h、72 h增殖活性均明顯降低(p<0.01)，細胞增殖活性隨暴露時間延長降低越為明顯(p<0.05)，與60％氧暴露組比較，95％氧暴露后增殖抑制效應(yīng)更為顯著(p<0.01)；40％氧暴露組及空氣對照組細胞ROS含量隨干預(yù)時間延長均無明顯變化，兩組間同時點ROS含量亦無顯

9、著差異，60％氧暴露組ROS水平隨暴露時間延長時間逐漸升高，暴露12 h、24 h，48 h、72 h與同時點空氣對照組比較有顯著性差異(p<0.01)，95％氧暴露后6 h細胞ROS含量即增多，且隨暴露時間延長ROS含量的增加越為顯著，各時點與空氣對照組比較差異均具統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。
　　結(jié)論：>60％氧可以時間依賴及濃度依賴的方式造成肺組織氧化應(yīng)激性損傷，誘導(dǎo)AECII死亡，抑制AECII增殖，導(dǎo)致未成熟肺發(fā)育停滯。

10、
　　第二部分:降鈣素基因相關(guān)肽對未成熟鼠肺氧化應(yīng)激性損傷的保護作用
　　目的:通過研究高氧暴露后肺組織CGRP含量動態(tài)變化和CGRP拮抗劑CGRP8-37干預(yù)后肺組織病理學(xué)、RAC、MDA含量、TAOC的改變，以及CGRP干預(yù)后AECII細胞增殖、存活的變化，了解CGRP在氧化應(yīng)激性肺損傷中的作用。
　　方法:95％氧暴露制備整體動物及原代AECII典型高氧損傷模型，放射免疫法檢測高氧暴露后肺組織勻漿CGRP含量的動

11、態(tài)變化，CGRP受體拮抗劑CGRP8-37干預(yù)后觀察肺組織病理學(xué)改變及RAC，酶標儀檢測MDA含量及組織TAOC水平，外源性CGRP干預(yù)后測定細胞內(nèi)ROS及TAOC，流式細胞學(xué)檢測AECII細胞死亡，MTT法評估細胞增殖。
　　結(jié)果:高氧暴露的肺組織CGRP含量隨高氧暴露時間的延長而逐漸增高，于7 d達到高峰，14 d時CGRP含量雖較前有所降低但仍明顯高于空氣對照組水平(p<0.01)，光鏡觀察發(fā)現(xiàn)高氧暴露后早期肺組織炎癥充血，

12、繼而出現(xiàn)肺泡數(shù)目減少，CGRP8-37干預(yù)后肺組織炎癥加重，肺泡結(jié)構(gòu)改建更為顯著，肺組織MDA含量在高氧暴露3d后顯著升高，同時TAOC明顯減弱，CGRP8-37干預(yù)后3 d、7 d、14 d MDA含量升高及TAOC降低的趨勢更明顯，與同時點單純高氧暴露組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05)；與空氣對照組相比，高氧暴露后細胞內(nèi)ROS水平明顯增高(p<0.01)而TAOC顯著降低(p<0.01)，同時死亡細胞比例顯著增多(p<0.01)、

13、細胞增殖活性減弱(p<0.01)，與單純高氧暴露組比較，CGRP干預(yù)后細胞ROS水平下降、TAOC提升，細胞增殖活性增強(p<0.01)，AECII死亡明顯下降(p<0.05)。
　　結(jié)論:氧化應(yīng)激損傷后肺組織CGRP含量增高可能是未成熟肺自我保護機制之一。CGRP可減弱氧化應(yīng)激對AECII增殖的抑制作用，減少細胞死亡從而改善AECII的存活，這可能是CGRP有利于肺發(fā)育及氧化應(yīng)激性肺損傷修復(fù)的關(guān)鍵。
　　第三部分:降鈣素基

14、因相關(guān)肽氧化應(yīng)激肺損傷保護作用的Wnt7b/β-catenin信號機制
　　目的:研究高氧暴露后早產(chǎn)鼠肺Wnt7b、β-catenin蛋白水平變化及高氧、CGRP干預(yù)后Wnt通路下游基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TCF、靶基因c-myc mRNA表達，了解Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是否參與了氧化應(yīng)激導(dǎo)致的AECII損傷死亡和肺發(fā)育障礙及其與CGRP肺保護作用的關(guān)系。
　　方法: western blot檢測95％高氧暴露早產(chǎn)鼠肺組織及高氧、CGR

15、P干預(yù)后原代AECII Wnt7b、β-catenin蛋白水平，RT-PCR測定TCF及c-myc mRNA表達。
　　結(jié)果:高氧暴露后3 d肺組織Wnt7b及β-catenin蛋白表達即較空氣對照組顯著增強(p<0.05)，7 d時蛋白水平達到峰值，14 d時表達有所下降，但仍明顯高于空氣對照組水平(p<0.05)；與空氣對照組比較，高氧組AECII TCF及c-myc mRNA表達明顯增強(p<0.01)，高氧+CGRP組較之