抗感染GS-DBM-PLA多孔復合生物活性材料的制備及相關研究.pdf

1、第一章DBM/PLA多孔復合生物活性材料的制備及相關性能研究
　　 目的:為制備具有局部抗感染能力的GS/DBM/PLA多孔復合生物活性材料,采用不引入高溫及有機溶劑殘留的綠色超臨界二氧化碳(SC-COz)合成法首先制備DBM/PLA多孔復合生物活性材料,確定與DBM復合的PLA分子量及DBM/PLA復合的最佳比例。
　　 方法:
　　 (1)選取健康供體皮質(zhì)骨、粉碎、過篩、選擇粒徑為200μm～300μm的骨粉

2、,按山西省醫(yī)用組織庫同種骨生產(chǎn)標準進行冷凍、清洗、脫鈣處理,制備DBM。
　　 (2)PLA最佳分子量的選擇:取不同分子量的PLA(以2倍質(zhì)量的NaCL作為造孔劑),放入超臨界SC-CO2反應釜內(nèi),調(diào)節(jié)溫度和壓力,在溫度37±1℃,壓力200±1Bar條件下,反應30min,打開反應釜,取出樣品,蒸餾水浸瀝48h去除造孔劑,冷凍干燥,三層無菌包裝,20kGy60Co輻照滅菌后備用。采用比重法檢測材料的孔隙率,微機控制萬能試驗機測

3、定材料的抗壓強度和彈性模量進行生物力學性能評價。
　　 (3)DBM/PLA復合比例確定:將DBM與10萬分子量PLA按質(zhì)量比1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3進行混合,相同方法加入造孔劑(與復合材料的質(zhì)量比為2:1),充分混勻后放入超臨界SC-CO2反應釜內(nèi),以相同的條件制備復合材料,蒸餾水浸瀝48h,冷凍干燥,三層無菌包裝,20kGy60CO輻照滅菌后備用。通過比重法評價材料的孔隙率,微機控制萬能試驗機測

4、定材料的抗壓強度和彈性模量進行生物力學性能評價,復蘇傳代L-929小鼠成纖維細胞株,MTT法檢測材料的細胞毒性,冷凍干燥后,離子濺射儀噴金,電子掃描顯微鏡(SEM)觀察孔隙情況。
　　 (4)采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)用(X)±S表示,孔隙率采用等級相關,各組間采用多樣本均數(shù)的單因素方差分析,若方差齊性,組間多重比較采用最小極差法(LSD),方差不齊,多重比較采用Tamhane's T2法。兩材料組間采用獨

5、立樣本均數(shù)的t檢驗或t’檢驗(方差不齊時)。細胞毒性試驗所測OD值采用析因設計方差分析,檢驗水準均為α=0.05。
　　 結果:
　　 (1)PLA分子量確定:①使用SC-CO2合成法制備的PLA多孔支架材料的孔隙率均大于60％,且隨著PLA分子量的增加而增大(r=0.909,P<0.001),50萬分子量的PLA孔隙率達到了85.52％,結構相當疏松。②10、50萬分子量的PLA支架材料在經(jīng)過抗壓實驗后,由于材料具有很

6、強的韌性,整體被壓扁,材料結構更加致密,而5萬分子量的PLA支架材料經(jīng)過抗壓實驗,材料被壓碎,說明5萬分子量PLA脆性較大,聚合后受外力作用易破碎。③生物力學檢測,10萬分子量PLA支架材料抗壓強度及彈性模量最高,分別為(264.03±41.11)MPa和(49.71±6.69)MPa,5萬分子量PLA支架材料抗壓強度及彈性模量次之,50萬分子量PLA支架材料抗壓強度及彈性模量很低,其彈性模量只有(2.95±0.48)MPa,各組間均存

7、在統(tǒng)計學差異。
　　 (2)DBM/PLA復合比例確定:①DBM/PLA復合材料大體觀察結構疏松,有較好的孔隙率,類似人體松質(zhì)骨樣結構。不同比例DBM/PLA復合材料孔隙率均大于60％,且隨著DBM含量的增加而增大(r=0.945,P<0.001),DBM/PLA復合材料的抗壓強度及彈性模量卻隨著DBM含量的增加而逐漸降低,當DBM含量大于60％時,力學性能下降顯著:抗壓縮強度(38.44±3.29)MPa和彈性模量(3.49±

8、0.55)MPa,與其余各組材料之間均存在顯著性差異。②各材料組不同時間點細胞OD值間有顯著差異(F=1256.695,P<0.001),各組間存在顯著差異(F=3584.657,P<0.001),材料與時間因素之間存在交互效應(F=224.571,P=0.000)。當DBM含量在50％以下時,DBM/PLA復合材料明顯的抑制了小鼠L929成纖維細胞的增殖,細胞評級為2-3級,有的甚至達到了4級,但隨著DBM比例的增大,細胞毒性逐減低,

9、達到50％后,基本與正常培養(yǎng)基組相同,對細胞增殖無明顯影響,細胞毒性評級為0級或1級,符合植入類材料的要求。
　　 (3)掃描電子顯微鏡觀察所制備的含60％DBM復合材料,DBM與PLA混合均勻,結合致密,材料孔隙分布均勻,孔隙大小大約在200μm-400μm之間,孔洞連通性好,且在孔隙內(nèi)壁上,仍可見大量孔徑為20μm-30μm左右的小孔隙。
　　 結論:
　　 (1)采用SC-CO2合成法制備的10萬分子量的P

10、LA多孔支架材料,具有較好的孔隙率及最佳的抗壓強度及彈性模量,更適合與DBM進行復合。
　　 (2)采用SC-CO2合成法制備的DBM/PLA多孔復合支架材料,孔隙率隨著DBM含量的增加而增大,力學性能隨著DBM含量的增加而減弱,細胞毒性隨著DBM含量的增加而逐漸降低,綜合孔隙率、生物力學性能及細胞毒性實驗,我們認為6:4為SC-CO2法制備DBM/PLA的最佳復合比例。
　　 第二章 GS/DBM/PLA多孔復合生物活

11、性材料的制備及緩釋性能研究
　　 目的:采用SC-CO2合成法制備硫酸慶大霉素(gentamicin sulfate GS)、DBM、PLA三者多孔復合生物活性材料(GS/DBM/PLA),評價GS/DBM/PLA復合材料的理化及緩釋性能。
　　 方法:
　　 (1)根據(jù)金黃色葡萄球菌可以形成細菌菌落的原理,利用平板法進行細菌計數(shù),制備金黃色葡萄球菌標準溶液,保證后續(xù)實驗中金黃色葡萄球菌數(shù)量恒定。
　　

12、(2)取輻照與未輻照慶大霉素粉末各1g,制備慶大霉素標準品容液,微生物檢測法,測定輻照與未輻照慶大霉素抑菌圈直徑,比較輻照前后慶大霉素效價；利用所測得的輻照后不同濃度慶大霉素稀釋液抑菌圈直徑,繪制慶大霉素濃度與抑菌圈直徑的半對數(shù)標準曲線,給出直線回歸方程。
　　 (3)按DBM/PLA(6/4)的比例分別取0.6gDBM(粒徑大小為200μm～300μm)、0.4gPLA(10萬分子量),0.5g慶大霉素粉末,2gNaCL顆粒造

13、孔劑,以SC-CO2合成法,與前述實驗相同的反應條件制備GS/DBM/PLA復合材料。
　　 (4)GS/DBM/PLA理化性能能測定:采用比重法檢測材料的孔隙率、微機控制萬能試驗機測定材料的抗壓強度和彈性模量進行生物力學性能評價,復蘇傳代L-929小鼠成纖維細胞株,MTT法檢測細胞毒性。
　　 (5)GS/DBM/PLA緩釋性能能測定:①將制備好的GS/DBM/PLA復合材料修剪成統(tǒng)一規(guī)格,準備15支試管,無菌條件下各

14、加入10ml生理鹽水,將制備好的材料放入試管1中,37℃浸泡24小時后取出,放入2號試管,依次至15d,使GS/DBM/PLA復合材料中的慶大霉素逐漸釋放于鹽水中,對1-15試管中的鹽水做抑菌試驗,測定其不同時間抑菌濃度并繪制體外釋放曲線。②將制備好的GS/DBM/PLA復合材料修剪成統(tǒng)一規(guī)格,行大鼠肌袋內(nèi)埋入實驗,于術后第1d、4d、7d、9d、12d、15d后取出植入材料顆粒周圍3mm肌肉組織,同時腹主動脈取血2ml(肝素抗凝),-

15、20℃低溫冰箱保存。在無菌條件下,取出保存的肌肉組織、血液,分別緩沖液勻漿,離心,取上清,微生物檢測法測定不同時間抑菌濃度并繪制體內(nèi)釋放曲線.
　　 (6)采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)用(X)±S表示,兩材料組問采用獨立樣本均數(shù)的t檢驗,配對資料采用配對(t)檢驗,采用直線回歸建立回歸方程,細胞相容性所測的OD值采用析因設計資料的方差分析法,檢驗水準為α=0.05。
　　 結果:
　　 (1)

16、對輻照前后慶大霉素抑菌圈直徑做配對t檢驗:t=0.020,P=0.984,無統(tǒng)計學差異,說明輻照對慶大霉素效價的影響很??；對輻照后慶大霉素濃度與抑菌圈直徑做直線回歸,慶大霉素濃度與抑菌圈直徑的直線回歸方程為:Y=7.576+5.113X,r=0.990,P<0.001,通過此方程可將抑菌圈直徑換算為GS濃度。
　　 (2)GS/DBM/PLA理化性能測定:
　　 ①GS/DBM/PLA孔隙率:GS/DBM/PLA及單純D

17、BM/PLA(6/4)材料的孔隙率做t檢驗,P>0.05,無統(tǒng)計學意義,GS/DBM/PLA復合材料孔隙率為77.076％,略低于單純DBM/PLA(6/4)復合材料的79.71％。
　　 ②GS/DBM/PLA生物力學性能:GS/DBM/PLA及單純DBM/PLA(6/4)材料的抗壓強度及彈性模量做t檢驗,P值均大于0.05,說明差異無顯著性,無統(tǒng)計學意義,GS/DBM/PLA復合材料的抗壓強度及彈性模量較單純DBM/PLA(

18、6/4)復合材料略有所下降,但影響不大。
　　 ③GS/DBM/PLA細胞毒性:各材料組不同時間點細胞OD值間有顯著差異(F=1376.194,P<0.001),各組間存在顯著差異(F=2.983,P<0.001),材料與時間因素之間存在交互效應(F=1376.194,P<0.000),從第3-7天,對照組、DBM/PLA組及GS/DBM/PLA組之間無統(tǒng)計學差異(P值均大于0.05),GS/DBM/PLA復合材料浸提液培養(yǎng)細胞

19、1～7天內(nèi)細胞增殖率均大于90％,細胞毒性評級為0級或1級,表明GS/DBM/PLA基本無細胞毒性與單純DBM/PLA(6:4)材料組類似。
　　 (3)GS/DBM/PLA緩釋性能能測定:
　　 ①GS/DBM/PLA體外緩釋性能:1-3dGS大量釋放,從第4d開始GS進入緩慢釋放過程,從第8天開始GS濃度基本穩(wěn)定在15-30μg/ml,第15天,GS濃度為16.96μg/ml,仍高于金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度(2μg

20、/ml),可起到抑菌效果。
　　 ②GS/DBM/PLA體內(nèi)緩釋性能:隨著時間的延長,GS濃度逐漸降低,第15天,局部肌肉中GS濃度仍能達到3.00μg/ml,仍高于金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度(2μg/ml),可起到抑菌效果,肉眼觀察血液中GS濃度抑菌圈,發(fā)現(xiàn)基本沒有出現(xiàn)抑菌圈,說明血液中GS濃度含量低于2μg/ml,無法起到抑菌效果,基本無全身毒副作用。
　　 結論:
　　 (1)輻照對慶大霉素效價的影響很小,

21、輻照前后慶大霉素的效價變化不大,利于與/DBM/PLA進行復合,后進行輻照滅菌處理。
　　 (2)采用SC-CO2合成法制備的GS/DBM/PLA多孔復合支架材料,具有較好的孔隙率,一定的生物力學強度,無細胞毒性,15天之內(nèi),不論體內(nèi)還是外從復合材料中緩釋出的GS均可以達到有效抑菌濃度,且全身毒副作用小。
　　 第三章GS/DBM/PLA多孔復合生物活性材料治療大鼠感染性股骨髁缺損實驗研究
　　 目的:建立大鼠股

22、骨髁缺損感染模型,植入DBM/PLA及GS/DBM/PLA多孔復合材料,評價DBM/PLA及GS/DBM/PLA多孔復合材料修復骨缺損及GS/DBM/PLA材料的抗感染能力,為今后可能的臨床應用提供實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 (1)大鼠股感染性股骨髁缺損模型建立及材料移植:
　　 ①取健康成年Wistar大鼠84只,4只作為空白對照組(A組)不做任何處理,其余各40只作為GS/DBM/PLA材料組(B組)及D

23、BM/PLA材料組(C組)。麻醉,平臥固定于操作臺,用直徑1.6mm的牙科球鉆制取大鼠雙側股骨髁缺損,無菌生理鹽水沖洗缺損,取出事先準備好的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus SA)標準溶液(1x1011CFU/ml),微量加樣器吸取10μl,注入股骨髁缺損,靜置30min后,將B(GS/DBM/PLA組)、C(DBM/PLA組)兩組材料分別等量(約80mg)植入缺損處,術肢不固定,常規(guī)飼養(yǎng)。
　　 ②術

24、后注意觀察動物的一般情況,于術后1d、4d、7d、9d、12d、15d,B、C兩組各取4只實驗動物,麻醉后,腹主動脈采血,進行白細胞計數(shù)。
　　 ③術后2w、4w、6w、8w,B、C兩組各取4只實驗動物,脫頸處死動物,無菌條件下截取雙側股骨髁缺損區(qū)域取2g左右骨塊,研磨、稱取1g研磨后骨塊,加入10ml生理鹽水,利用平板法進行細菌學計數(shù)。
　　 (2)大鼠股感染性股骨髁缺損修復實驗:
　　 ①取健康成年Wista

25、r大鼠36只,隨機分成3組,植入的材料分別為:A組:GS/DBM/PLA材料組,(缺損處加入SA)；B組:DBM/PLA材料組(缺損處加入SA)；C組:單純DBM/PLA材料組(對照組,缺損處不加入SA,不感染實驗動物)。
　　 ②術后4w、6w、8w,每組3只/6側,麻醉后攝X光片作放射線檢查,了解新骨生長和缺損修復情況,用Image-Pro Plus5.0圖像分析軟件測取缺損修復區(qū)單位面積灰度值,以代替骨密度評價缺損區(qū)骨修復

26、情況。
　　 ③術后6w、8w時,每組4只,另取4只正常同年齡同體重動物作為對照組(D組),截取左側股骨髁,將股骨髁平放固定于生物力學機工作臺上,壓緊后,啟動壓力裝置以5mm/min的加載速度施壓,觀察股骨髁位移/時間和位移/載荷變化,當位移達2mm(股骨髁厚度約5mm)視為結構破壞,記錄破斷載荷(受壓面積約24mm2),評價承載能力。
　　 ④術后4w、6w、8w時,每組4只,截取右側股骨髁,經(jīng)固定、脫鈣、脫水、包埋后

27、,用硬組織切片機制取厚度為5μm切片,進行HE染色,光學顯微鏡下觀察植骨區(qū)骨愈合情況。
　　 (3)采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)用(X)±S表示,各組間采用多樣本均數(shù)的單向方差分析,若方差齊性,組間多重比較采用最小極差法(LSD),方差不齊,多重比較采用Tamhane's T2法,白細胞計數(shù)值采用析因設計方差分析,檢驗水準為α=0.05。
　　 結果:
　　 (1)大鼠股感染性股骨髁缺損模型建

28、立及材料移植:
　　 ①大體觀察:術后動物手術部位均出現(xiàn)一定程度的腫脹,于術后2w無菌條件下取材,發(fā)現(xiàn)C組動物股骨髁缺損處出現(xiàn)了大量的膿性分泌物,取分泌物接種培養(yǎng),革蘭氏染色證明為金黃色葡萄球菌。
　　 ②白細胞計數(shù),GS/DBM/PLA組與DBM/PLA組之間有統(tǒng)計學差異(F=222.141,P<0.001),兩組材料不同時間點白細胞計數(shù)值間有顯著差異(F=21.414,P<0.001),材料與時間因素之間存在交互效應

29、(F=224.571,P<0.001),術后15d內(nèi),GS/DBM/PLA組白細胞數(shù)明顯低于DBM/PLA組,DBM/PLA組15d內(nèi),白細胞數(shù)均明顯高于正常值(4.545±1.358)×109/L,GS/DBM/PLA組白細胞數(shù)只是前3d有所升高,從第4d起開始就趨于正常。
　　 ③骨組織細菌密度:對2w、4w、6w、8w分別進行方差分析,結果類似,差異均有顯著性:2w時F=52.718、P<0.001,4w時F=94.462

30、、P<0.001,6w時F=138.535、P<0.001,8w時F=42.026、P<0.001；GS/DBM/PLA組細菌數(shù)量明顯低于DBM/PLA組,兩組細菌數(shù)量至少相差3個以上數(shù)量級,表明GS/DBM/PLA組材料能有效抑制細菌的生長繁殖。
　　 (2)大鼠股感染性股骨髁缺損修復實驗:
　　 ①X線觀察結果:A組(GS/DBM/PLA含SA組)動物植入4w時,缺損修復區(qū)有較為明顯且均勻絮狀阻射影,缺損中心密度較高

31、；植入6w時,絮狀阻射影更為致密,缺損中心已基本無透光區(qū)；植入8w時,阻射影趨于致密,缺損區(qū)密度接近于正常骨質(zhì)與C組表現(xiàn)相似。B組(DBM/PLA含SA組)植入8w時,絮狀阻射影進一步致密,缺損中心透光區(qū)變小,不規(guī)則。
　　 ②骨密度計量分析:4w、6w、8w分別取材,對灰度值(骨密度)進行方差分析,差異均有顯著性:4w時F=56.248、P<0.001,6w時F=57.704、P<0.001,8w時F=25.793、P<0.0

32、01:進一步作組間兩兩比較,各組間也均存在統(tǒng)計學差別(P<0.001),C組(DBM/PLA組,無SA)灰度值最大,B組(DBM/PLA組,含SA)灰度值最小,且A組(GS/DBM/PLA組,含SA)明顯高于B組(DBM/PLA組,含SA),差異有統(tǒng)計學意義,從一個角度說明了DBM/PLA材料明顯促進了骨缺損修復,GS/DBM/PLA通過局部抗感染能力,有利于骨缺損的修復。
　　 ③移植物抗壓生物力學測試:6w、8w取材,對破斷

33、載荷和破斷強度做方差分析,差異有顯著性,6w時F=50.381、P<0.001,8w時F=93.291、P<0.001；進一步作組間兩兩比較,除6w,A,C兩組無統(tǒng)計學意義外(P=0.097),其余各組間均存在統(tǒng)計學差別(P<0.05),D組(正常組)破斷載荷和破斷強度最高,C組(DBM/PLA組,無SA)次之,B組(DBM/PLA組,含SA)破斷載荷和破斷強度最低,且A組(GS/DBM/PLA組,含SA)明顯高于B組(DBM/PLA組

34、,含SA),差異有統(tǒng)計學意義,說明DBM/PLA材料明顯促進了骨缺損修復,GS/DBM/PLA通過局部抗感染能力,有利于骨缺損的修復。
　　 ④組織學觀察:A組(GS/DBM/PLA組,含SA)植入4w,植入材料可見少量炎性組織長入,植入6w,間充質(zhì)細胞向植入骨內(nèi)長入,內(nèi)可見少量炎癥細胞及多核細胞,植入材料周圍可見成骨細胞；植入8w,新生骨組織長滿植入?yún)^(qū),達到骨愈合與C組(DBM/PLA組,無SA)八周時情況類似。B組(DBM/