線粒體靶向藥物納米給藥系統的構建及抗腫瘤研究.pdf

1、目的：本研究以透明質酸(hyaluronic acid，HA)作為載體骨架，分別構建pH敏感的透明質酸-阿霉素-三苯基膦(HA-hydra-DOX-TPP)納米給藥系統用以實現阿霉素(doxorubicin，DOX)的線粒體靶向遞送、以及谷胱甘肽響應的非病毒基因載體N，N，N-三甲基胱胺修飾的透明質酸-精胺-阿霉素-三苯基膦(HSTC)，用以共載線粒體靶向藥物和siRNA，以提高DOX抗腫瘤活性，克服腫瘤耐藥，降低全身毒副作用。

2、　　方法：1.合成線粒體靶向藥物阿霉素-三苯基膦(DOX-TPP)，并將DOX-TPP通過腙鍵接枝到HA上制備成HA-hydra-DOX-TPP納米制劑。此外，構建N，N，N-三甲基胱胺修飾的HSTC非病毒基因載體，通過核磁共振、紅外光譜和液相質譜對產物進行結構鑒定，并對HA-hydra-DOX-TPP和HSTC/siRNA復合物的粒徑和電鏡進行考察;2.采用MTT法評價HA-hydra-DOX-TPP和HSTC/siRNA復合物的體外

3、細胞毒性，通過共聚焦顯微鏡觀察DOX-TPP、HA-hydra-DOX-TPP和HSTC/siRNA復合物在細胞內的分布及藥物釋放。流式細胞術評價HA-hydra-DOX-TPP對MCF-7/ADR細胞內線粒體膜電位、活性氧(reactive oxygen species，ROS)產量、Caspase3活性的影響和細胞凋亡情況，以及考察HSTC/siRNA復合物的細胞攝取情況;3.利用瓊脂糖凝膠電泳考察HSTC攜載siRNA的能力，確定

4、載體與siRNA的結合比例。同時，考察不同濃度的二硫蘇糖醇(DTT)對siRNA釋放的影響。通過實時熒光定量PCR法和蛋白免疫印跡實驗測定HSTC/siTwist復合物對腫瘤細胞內Twist mRNA生成的抑制作用;4.建立MCF-7/ADR荷瘤裸鼠模型，共聚焦顯微鏡觀察腫瘤組織中藥物的累積。采用免疫組化染色法考察HA-hydra-DOX-TPP引起腫瘤組織中細胞色素C產量變化，通過TUNEL實驗考察引起腫瘤組織中細胞凋亡的情況。采用H

5、&E染色法觀察心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟和腫瘤的組織形態(tài)，評價HA-hydra-DOX-TPP的體內安全性。
　　結果：通過核磁共振、紅外光譜和液相質譜檢測，DOX和TPP成功通過酰胺鍵結合形成DOX-TPP，共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現其具有良好的線粒體靶向功能，DOX-TPP的腫瘤細胞毒性明顯高于DOX。進一步將其與透明質酸結合，得到HA-hydra-DOX-TPP納米制劑，經測定粒徑為192nm，電位為-24mV，形態(tài)為球形納米粒子

6、，且具有較好的分散性。HA-hydra-DOX-TPP的體外釋藥具有pH依賴性，在pH5.0的緩沖液中，DOX-TPP可以快速釋放。共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現HA-hydra-DOX-TPP釋放出的DOX-TPP最終靶向到線粒體。相對于DOX，納米制劑HA-hydra-DOX-TPP可以增加細胞對藥物的攝取，增強細胞內Caspase3的活性，誘導產生較多的ROS，從而表現出較大的細胞毒性。體內抗腫瘤活性結果表明，HA-hydra-DOX-T

7、PP可以提高腫瘤組織的藥物累積量，導致腫瘤細胞產生較多的細胞色素C，更顯著的誘導腫瘤細胞凋亡。并且沒有對心臟、肝臟、脾、肺、腎臟等正常組織器官產生明顯的毒性，顯示了較高的安全性。經核磁共振和液相質譜檢測，合成了N，N，N-三甲基胱胺修飾的非病毒基因載體HSTC，瓊脂糖凝膠實驗表明當HSTC與siRNA的質量比為100∶1時，可以完全阻滯siRNA，在這個比例下制得HSTC/siRNA復合物粒徑為80nm，電位為17mV，具有規(guī)則的形態(tài)。

8、HSTC/siRNA復合物具有谷胱甘肽響應性釋放siRNA的功能，且腫瘤細胞內高濃度的谷胱甘肽有利于siRNA的釋放。胞內轉運及溶酶體逃逸的研究表明，其可以成功從溶酶體中逃逸，釋放出的藥物DOX-TPP能夠靶向到線粒體，并且在細胞質中釋放siRNA。HSTC/siRNA復合物可以提高細胞對siRNA的攝取，抑制腫瘤細胞內Twist mRNA的表達。
　　結論：本研究成功構建了pH敏感的HA-hydra-DOX-TPP納米給藥系統，