家蠶苯丙氨酸羥化酶基因(BmPAH)和色氨酸羥化酶基因(BmTRH)克隆、表達及功能研究.pdf

1、芳香族氨基酸羥化酶(AAAH)對芳香族氨基酸代謝具有重要的生理作用。芳香族氨基酸羥化酶家族(AAAHs)包括苯丙氨酸羥化酶(PAH)、色氨酸羥化酶(TRH)和酪氨酸羥化酶(TH)。苯丙氨酸羥化酶(PAH)廣泛分布于動物、植物和微生物。苯丙氨酸羥化酶(PAH)是苯丙氨酸代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，催化苯丙氨酸轉(zhuǎn)變成酪氨酸，是哺乳動物體內(nèi)苯丙氨酸正常分解代謝唯一途徑的限速步驟。人類PAH基因與重要代謝疾病苯丙酮尿癥(PKU)密切相關(guān)，線蟲的PAH

2、基因與表皮的黑色素合成有關(guān)，果蠅PAH基因與表皮硬化、眼色素合成以及神經(jīng)活動有關(guān)，埃及伊蚊PAH基因與防御免疫黑化有關(guān)，但至今未見關(guān)于鱗翅目昆蟲PAH基因的相關(guān)報道。家蠶作為鱗翅目昆蟲代表，明確家蠶PAH基因(BmPAH)的作用和功能，對充分發(fā)揮家蠶的模式作用，在農(nóng)林上建立防治鱗翅目害蟲的新技術(shù)和新途徑具有重要意義，同時對人類重要疾病PKU的治療也具有參考價值。
　　 色氨酸羥化酶(TRH)是5-羥色胺(5-HT)合成的限速酶和

3、關(guān)鍵酶，其活性的高低直接決定著神經(jīng)元內(nèi)5-HT的含量，色氨酸羥化酶(TRH)是確定5-HT能神經(jīng)元的最好標志。5-HT廣泛存在于脊椎動物和無脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)，參與多種行為和發(fā)育調(diào)節(jié)。臨床上，TRH基因的多態(tài)性伴隨多種心理障礙疾病，如抑郁癥、強迫癥、厭食癥、食欲過旺癥、老年前癡呆癥以及精神分裂癥等。昆蟲上，關(guān)于TRH基因的研究報道很少，僅果蠅中有相關(guān)研究。家蠶作為模式生物，克隆和表達家蠶TRH基因(BmTRH)對推進識別昆蟲5-HT能神

4、經(jīng)元的形態(tài)、類型、分布以及各神經(jīng)元之間的聯(lián)系具有重要意義。
　　 基于上述理由，本論文對家蠶PAH基因(BmPAH)和TRH基因(BmTRH)進行了克隆、表達及功能研究，主要結(jié)果如下：
　　 1、BmPAH基因克隆、序列分析及表達模式研究
　　 本研究克隆的BmPAH基因cDNA序列長1433bp，其中ORF序列長1371bp。BmPAH基因位于家蠶1號染色體nscaf2734上，包含6個外顯子和5個內(nèi)含子，外顯

5、子/內(nèi)含子邊界均符合GT-AG規(guī)則；BmPAH基因編碼456個氨基酸，預測蛋白的分子量大小約為52kDa，等電點為5.46。預測顯示BmPAH蛋白包含完整的ACT結(jié)構(gòu)域和羥化苯丙氨酸的結(jié)構(gòu)域，無信號肽序列，屬非分泌蛋白。
　　 BmPAH基因組織表達分析結(jié)果表明：BmPAH基因轉(zhuǎn)錄本在家蠶5齡3天的精巢、卵巢、頭、體壁和脂肪體中有高量表達，血液中有表達但不高，在絲腺、中腸、氣管和馬氏管中表達量低或不表達。芯片數(shù)據(jù)和RT-PCR實

6、驗結(jié)果完全一致。
　　 以家蠶個體總cDNA為模板，RT-PCR實驗結(jié)果顯示，BmPAH基因轉(zhuǎn)錄本在家蠶胚胎期表達量依胚胎發(fā)育大小而不同，發(fā)育時間長的大胚胎比發(fā)育時間短的小胚胎表達量高，這與家蠶胚胎后期合成大量黑色素比較一致；BmPAH基因轉(zhuǎn)錄本在家蠶幼蟲各齡的眠蠶起蠶都有表達，與幼蟲蛻皮合成大量黑色素、表皮重新著色比較一致；BmPAH基因轉(zhuǎn)錄本在家蠶變態(tài)期的表達量，總體上明顯少于胚胎和幼蟲兩個階段。
　　 2、BmPA

7、H基因原核表達、western blotting及免疫組化分析
　　 本研究構(gòu)建了序列和插入方向都正確的BmPAH基因原核表達載體--BmPAH/pET-28a(+)重組質(zhì)粒。在原核中表達的蛋白出現(xiàn)于沉淀，經(jīng)質(zhì)譜鑒定的確為BmPAH基因編碼的蛋白。用BmPAH基因原核表達蛋白免疫家兔獲得的多克隆抗體進行免疫印跡和免疫組化實驗。western blotting實驗顯示，家蠶幼蟲5齡3天的脂肪體、卵巢和精巢3個組織總蛋白中有BmPA

8、H蛋白的陽性信號，脂肪體中信號相對較強；BmPAH蛋白在脂肪體中大量表達，與家蠶脂肪體象人類肝臟、是苯丙氨酸代謝的主要場所一致。5齡3天幼蟲組織的免疫組化結(jié)果顯示，在家蠶頭部整個組織都有BmPAH蛋白的陽性信號，與家蠶頭部分布有黑色素、著生許多感覺器官一致；在體壁的真皮層和內(nèi)表皮中均檢測到BmPAH蛋白的陽性信號，與真皮細胞和內(nèi)表皮是體壁黑色素等物質(zhì)合成的場所相符；在精巢膜和卵巢膜上BmPAH蛋白信號較強，精巢膜內(nèi)生精囊等也有目的蛋白信

9、號，可能與家蠶生殖腺發(fā)育以及生殖細胞成熟有關(guān)；在中樞神經(jīng)組織中BmPAH蛋白陽性信號較強，可能與神經(jīng)活動有關(guān)。免疫組化實驗結(jié)果與RT-PCR檢測結(jié)果完全吻合，但與免疫印跡結(jié)果不一致，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是目標蛋白在總蛋白中含量太低以致免疫印跡檢測不到引起。
　　 3、BmPAH基因在家蠶黑色素合成上的功能研究
　　 無論用自己合成的dsRNA片段還是公司生產(chǎn)的siRNA，注射產(chǎn)下3小時以內(nèi)的蠶卵，都出現(xiàn)一定數(shù)量的著色淺

10、、著色不均甚至不著色的發(fā)育但不孵化的陽性表型胚胎，熒光定量PCR檢測結(jié)果均顯示，陽性表型胚胎中的BmPAH基因轉(zhuǎn)錄本表達量明顯低于對照，暗示出現(xiàn)的陽性表型與BmPAH基因被RNA干涉密切相關(guān)。HPLC-FLU分析siRNA注射的蠶卵，結(jié)果siRNA陽性個體中酪氨酸含量明顯低于siRNA陰性個體和對照，且siRNA陽性個體中的苯丙氨酸有曾積累的痕跡，這與BmPAH基因被干涉，轉(zhuǎn)錄本表達量降低，基因產(chǎn)物量減少，催化反應(yīng)活動變?nèi)?，形成酪氨酸?/p>

11、產(chǎn)物量降低一致。HPLC-FLU分析結(jié)果與熒光定量PCR檢測結(jié)果能夠相互印證，相互吻合。一方面說明我們克隆的家蠶BmPAH基因編碼的蛋白具有羥化苯丙氨酸轉(zhuǎn)變成酪氨酸的活力，是名副其實的PAH基因；另一方面說明BmPAH基因參與了家蠶胚胎期黑色素合成，是家蠶胚胎期黑色素合成的關(guān)鍵基因之一。
　　 用PAH抑制劑注射普斑蠶基礎(chǔ)斑紋的一側(cè)，與另一側(cè)未注射的對稱斑紋相比，出現(xiàn)注射處斑紋顏色不同程度的變淡或消失的陽性個體，陽性個體發(fā)生率隨

12、注射劑量的增加而增加，這說明家蠶幼蟲斑紋黑色素合成與BmPAH活性密切相關(guān)。用PAH抑制劑培養(yǎng)含有半月紋位置的體壁，表皮斑紋處著色很淺或不著色，而用PAH抑制劑和酪氨酸同時培養(yǎng)體壁，表皮斑紋處有明顯的黑色素合成沉積，這不僅進一步說明表皮斑紋黑色素合成與BmPAH活性密切相關(guān)，而且說明BmPAH催化形成的酪氨酸是幼蟲斑紋黑色素合成的主要來源。綜合分析PAH抑制劑注射和培養(yǎng)體壁實驗結(jié)果，認為BmPAH催化苯丙氨酸形成的酪氨酸是家蠶幼蟲斑紋黑

13、色素合成的主要來源，苯丙氨酸是家蠶幼蟲斑紋黑色素合成的重要前驅(qū)物，BmPAH基因參與了家蠶幼蟲斑紋黑色素的合成，是家蠶幼蟲斑紋黑色素合成的關(guān)鍵基因之一。
　　 縱觀家蠶整個生命周期，胚胎期著色和幼蟲期斑紋重新著色，黑色素類物質(zhì)合成最為旺盛。苯丙氨酸是家蠶必需氨基酸，家蠶體內(nèi)不能自己合成。綜合家蠶這些生理特點和前面的實驗結(jié)果分析認為：BmPAH基因參與了家蠶黑色素合成，是家蠶黑色素合成途徑上的關(guān)鍵基因之一；BmPAH催化苯丙氨酸轉(zhuǎn)

14、化成酪氨酸是家蠶黑色素合成途徑上的一個重要反應(yīng)步驟，苯丙氨酸是家蠶黑色素合成最前端、最原始的前驅(qū)物；苯丙氨酸→→→→酪氨酸是家蠶黑色素合成途徑上的第一個反應(yīng)步驟。
　　 4、BmTRH基因克隆、序列分析及表達模式研究
　　 本研究克隆的BmTRH基因cDNA序列長1520bp，其中ORF序列長1509bp。BmTRH基因位于家蠶1號染色體nscaf1690上，包含9個外顯子和8個內(nèi)含子，外顯子/內(nèi)含子邊界均符合GT-AG

15、規(guī)則；BmTRH基因編碼502個氨基酸，預測蛋白的分子量大小約為57 kDa，等電點為5.72。預測顯示BmTRH蛋白包含一個ACT結(jié)構(gòu)域和典型的羥化色氨酸的催化結(jié)構(gòu)域，無信號肽序列，屬非分泌蛋白。
　　 RT-PCR檢測結(jié)果表明，在家蠶幼蟲5齡3天11個組織中，BmTRH基因轉(zhuǎn)錄本僅在頭和中樞神經(jīng)表達，其中在中樞神經(jīng)的表達量比頭高。以家蠶個體總cDNA為模板，RT-PCR檢測家蠶胚胎、幼蟲及變態(tài)4個發(fā)育階段39個時間點，僅有一

16、個時間點出現(xiàn)了擴增帶。
　　 5、BmTRH基因原核表達、western blotting及免疫組化分析
　　 本研究構(gòu)建了序列和插入方向都正確的BmTRH基因原核表達載體--BmTRH/pET-28a(+)重組質(zhì)粒。在原核中表達的蛋白出現(xiàn)于沉淀，經(jīng)質(zhì)譜鑒定確實為BmTRH基因編碼的蛋白。用BmTRH基因原核表達蛋白免疫家兔獲得的多克隆抗體進行免疫印跡和免疫組化實驗。western blotting結(jié)果顯示，家蠶5齡3天

17、幼蟲9個組織總蛋白中沒有出現(xiàn)BmTRH蛋白的陽性信號；家蠶5齡3天幼蟲組織免疫組化顯示，在頭部有BmTRH蛋白的陽性信號，在中樞神經(jīng)組織中目的蛋白的信號較強，在體壁、精巢、卵巢等組織沒有檢測到目的蛋白的陽性信號。免疫組化結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致，但與免疫印跡的結(jié)果不一致，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是由于目標蛋白在總蛋白中的含量太低以致免疫印跡檢測不到所致。BmTRH基因僅在家蠶神經(jīng)活動非常豐富的頭部組織，和專一進行神經(jīng)活動的中樞神經(jīng)組織表