miRNA150在血壓調(diào)節(jié)中作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、微小RNA(microRNA，miRNA)作為一種內(nèi)源性的非編碼的RNA，通過(guò)對(duì)靶基因mRNA的降解或翻譯抑制來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)。miRNA150在免疫調(diào)節(jié)作用已被知曉，而其潛在的心血管系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用還不清楚。本研究?jī)?nèi)容包括：1、系統(tǒng)分析miRNA150敲除(knockout，KO)小鼠的心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)(Homeostasis)，是否具有心肌細(xì)胞肥大，腎臟損害等表現(xiàn)；2、從整體水平，分子水平到細(xì)胞水平對(duì)內(nèi)皮功能損害，氧化應(yīng)激等指標(biāo)分析，探索出

2、現(xiàn)上述表現(xiàn)的可能機(jī)制，并予依普利酮(Eplereone，EPL)進(jìn)行短期干預(yù)；3、通過(guò)衰老相關(guān)腎臟損害的機(jī)制分析，分析導(dǎo)致腎臟損害可能的病理生理機(jī)制，為進(jìn)一步探索miRNA150在調(diào)節(jié)血壓以及對(duì)腎臟損害的機(jī)制提供線索。全文分為三部分。
　　第一部分，miRNA150敲除小鼠的心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)
　　[目的]系統(tǒng)研究miRNA150-KO小鼠的心血管系統(tǒng)表現(xiàn)。
　　[方法]miRNA150-KO小鼠(KO組，n=8)與野生型

3、小鼠比較(WT組，n=8)，尾袖法(tail-cuff method)監(jiān)測(cè)血壓變化，16周后觀察心臟、腎臟、腎上腺的形態(tài)學(xué)改變及重量指數(shù)，HE染色觀察心肌組織結(jié)構(gòu)變化和心肌細(xì)胞橫切面積(cardiomyctye cross-sectional area，CSA)；三色法(Masson-Trichrome staining)觀察腎臟組織結(jié)構(gòu)改變；免疫熒光(immunofluorescence)腎上腺皮質(zhì)改變；流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)T淋巴細(xì)胞、B淋

4、巴細(xì)胞以及B1細(xì)胞表達(dá)。
　　[結(jié)果](1)miRNA150-KO小鼠在11周齡始出現(xiàn)收縮壓升高，并持續(xù)存在；(2)腎上腺重量指數(shù)升高(p<0.05)，伴有腎上腺皮質(zhì)增生；(3)KO脾臟B1細(xì)胞含量是WT組的2.6倍；(4)較WT組，KO組CSA顯著增加；(5)KO組腎小球和腎小管間質(zhì)膠原沉積明顯。
　　[結(jié)論]miRNA150-KO小鼠表現(xiàn)出高血壓的特點(diǎn)，脾臟B1細(xì)胞擴(kuò)增，心肌細(xì)胞肥大，腎上腺增大及腎皮質(zhì)增厚和腎臟結(jié)構(gòu)性損

5、害。
　　第二部分，miRNA150在血壓調(diào)節(jié)中作用機(jī)制的初步研究
　　第一節(jié)，miRNA150-KO小鼠CYP11B2表達(dá)和內(nèi)皮功能變化研究
　　[目的]通過(guò)研究醛固酮合成酶(aldosterone synthase)CYP11B2和內(nèi)皮功能的變化來(lái)初步探究miRNA150-KO小鼠高血壓形成的機(jī)制。
　　[方法]miRNA150-KO小鼠(KO組，n=8)與野生型WT小鼠，在20周齡時(shí)采血漿測(cè)醛固酮水平，免疫

6、組化和免疫印跡法檢測(cè)CYP11B2的表達(dá)；選取主動(dòng)脈行內(nèi)皮舒張功能檢測(cè)；DHE staining檢測(cè)主動(dòng)脈，腎臟，心臟原位超氧化物的表達(dá)；蘇木精化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)主動(dòng)脈的NADPH氧化酶的活性。
　　[結(jié)果](1)KO組血漿醛固酮水平較WT組高(P<0.05)；(2)CYP11B2水平，IHC和Western-blot檢測(cè)KO組較WT組均高(P<0.05，P<0.01)；(3)與WT組比較，KO組主動(dòng)脈內(nèi)皮舒張功能受損(P<0.05)

7、；(4)KO組超氧化物生成較WT組為高(P<0.05)，其NADPH氧化酶活性也明顯增強(qiáng)(P<0.01)。
　　[結(jié)論]醛固酮合成酶表達(dá)增加和主動(dòng)脈內(nèi)皮舒張功能受損可能是miRNA150-KO小鼠血壓升高的機(jī)制。
　　第二節(jié)，依普利酮短期干預(yù)實(shí)驗(yàn)
　　[目的]觀察依普利酮(Eplereone，EPL)對(duì)miRNA150-KO小鼠血壓水平、主動(dòng)脈內(nèi)皮功能及氧化應(yīng)激產(chǎn)物的影響，以進(jìn)一步探討miRNA150-KO小鼠血壓發(fā)生

8、的可能機(jī)制。
　　[方法]miRNA150-KO小鼠(n=12)隨機(jī)分為DMSO組(KO-DMSO)和EPL組(KO-EPL)，(n=6)；WT小鼠分成DMSO組(WT-DMSO)和EPL組(WT-EPL)(n=6)。EPL組干預(yù)為50mg/Kg.day腹腔注射，連續(xù)干預(yù)5天。(1)觀察小鼠體重、尿量變化；(2)并觀察組織器官重量指數(shù)變化及血漿醛固酮水平變化；(3)DHE staining法觀察腎臟、主動(dòng)脈超氧化物變化；(4)NA

9、DPH氧化酶活性變化情況；(5)免疫組化8-OHDG的表達(dá)；(6)EPL組對(duì)腎臟結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用。
　　[結(jié)果](1)EPL組(KO-EPL)血壓水平下降，較KO-DMSO為顯(P<0.01)；(2)EPL干預(yù)使KO組尿量增加(P<0.05)，而血漿醛固酮水平?jīng)]有顯著性變化；(3)EPL改善KO小鼠內(nèi)皮功能(P<0.05)，并下調(diào)NADPH氧化酶活性(P<0.05)；(4)EPL減少腎臟和主動(dòng)脈的超氧化物產(chǎn)生(P<0.05，P<0.

10、01)；(5)EPL促使8-OHDG表達(dá)降低。
　　[結(jié)論]依普利酮短期干預(yù)研究能降低KO小鼠血壓水平，抑制NADPH氧化酶活性，改善主動(dòng)脈內(nèi)皮功能，逆轉(zhuǎn)腎臟損害。
　　第三部分，衰老相關(guān)的腎臟損害因素分析
　　[目的]檢測(cè)在老年大鼠腎臟中klotho，內(nèi)皮素(ET)受體和超氧化物的變化，以及是否這些變化在認(rèn)知功能障礙的大鼠中是否加劇。
　　[方法]根據(jù)認(rèn)知功能測(cè)試，將20只大鼠(雄性，27個(gè)月)隨機(jī)分為兩組，損

11、傷的老年大鼠組(n=9)和未損傷的老年大鼠組(n=11)。12個(gè)月齡大鼠(n=10)作為年輕未損傷組。采集血清ELISA測(cè)定血清肌酐和ET-1的濃度。采用PAS染色和三色染色評(píng)價(jià)腎組織學(xué)改變。DHE染色測(cè)定腎臟原位超氧化物。采用免疫組化和Western印跡檢測(cè)Klotho蛋白，內(nèi)皮素受體ET，Nox2，IL-6，和MnSOD在腎皮質(zhì)和髓質(zhì)的表達(dá)。
　　[結(jié)果]認(rèn)知功能損傷的老年大鼠組血清肌酐顯著增加(p<0.05)，提示腎功能受損

12、。老年大鼠出現(xiàn)腎小球硬化和小管間質(zhì)性纖維化。認(rèn)知功能損傷的老年大鼠組較認(rèn)知功能未損傷的老年大鼠上述這些病理變化顯著的加劇(p<0.01)。老年大鼠腎皮質(zhì)和髓質(zhì)klotho蛋白表達(dá)顯著下降，IL-6，Nox2，ET-a受體和超氧化物超的表達(dá)增加，然而老年大鼠腎臟的線粒體超氧化物歧化酶(MnSOD)和ETb受體的表達(dá)明顯降低。認(rèn)知功能損傷的老年大鼠組較認(rèn)知功能未損傷的老年大鼠組上述這些變化更為明顯。
　　[結(jié)論]認(rèn)知功能損傷的老年大鼠