miRNA150在血壓調節(jié)中作用機制的初步研究.pdf

1、微小RNA(microRNA，miRNA)作為一種內源性的非編碼的RNA，通過對靶基因mRNA的降解或翻譯抑制來調節(jié)基因表達。miRNA150在免疫調節(jié)作用已被知曉，而其潛在的心血管系統(tǒng)調節(jié)作用還不清楚。本研究內容包括：1、系統(tǒng)分析miRNA150敲除(knockout，KO)小鼠的心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)(Homeostasis)，是否具有心肌細胞肥大，腎臟損害等表現(xiàn)；2、從整體水平，分子水平到細胞水平對內皮功能損害，氧化應激等指標分析，探索出

2、現(xiàn)上述表現(xiàn)的可能機制，并予依普利酮(Eplereone，EPL)進行短期干預；3、通過衰老相關腎臟損害的機制分析，分析導致腎臟損害可能的病理生理機制，為進一步探索miRNA150在調節(jié)血壓以及對腎臟損害的機制提供線索。全文分為三部分。
　　第一部分，miRNA150敲除小鼠的心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)
　　[目的]系統(tǒng)研究miRNA150-KO小鼠的心血管系統(tǒng)表現(xiàn)。
　　[方法]miRNA150-KO小鼠(KO組，n=8)與野生型

3、小鼠比較(WT組，n=8)，尾袖法(tail-cuff method)監(jiān)測血壓變化，16周后觀察心臟、腎臟、腎上腺的形態(tài)學改變及重量指數(shù)，HE染色觀察心肌組織結構變化和心肌細胞橫切面積(cardiomyctye cross-sectional area，CSA)；三色法(Masson-Trichrome staining)觀察腎臟組織結構改變；免疫熒光(immunofluorescence)腎上腺皮質改變；流式細胞儀監(jiān)測T淋巴細胞、B淋

4、巴細胞以及B1細胞表達。
　　[結果](1)miRNA150-KO小鼠在11周齡始出現(xiàn)收縮壓升高，并持續(xù)存在；(2)腎上腺重量指數(shù)升高(p<0.05)，伴有腎上腺皮質增生；(3)KO脾臟B1細胞含量是WT組的2.6倍；(4)較WT組，KO組CSA顯著增加；(5)KO組腎小球和腎小管間質膠原沉積明顯。
　　[結論]miRNA150-KO小鼠表現(xiàn)出高血壓的特點，脾臟B1細胞擴增，心肌細胞肥大，腎上腺增大及腎皮質增厚和腎臟結構性損

5、害。
　　第二部分，miRNA150在血壓調節(jié)中作用機制的初步研究
　　第一節(jié)，miRNA150-KO小鼠CYP11B2表達和內皮功能變化研究
　　[目的]通過研究醛固酮合成酶(aldosterone synthase)CYP11B2和內皮功能的變化來初步探究miRNA150-KO小鼠高血壓形成的機制。
　　[方法]miRNA150-KO小鼠(KO組，n=8)與野生型WT小鼠，在20周齡時采血漿測醛固酮水平，免疫

6、組化和免疫印跡法檢測CYP11B2的表達；選取主動脈行內皮舒張功能檢測；DHE staining檢測主動脈，腎臟，心臟原位超氧化物的表達；蘇木精化學發(fā)光法檢測主動脈的NADPH氧化酶的活性。
　　[結果](1)KO組血漿醛固酮水平較WT組高(P<0.05)；(2)CYP11B2水平，IHC和Western-blot檢測KO組較WT組均高(P<0.05，P<0.01)；(3)與WT組比較，KO組主動脈內皮舒張功能受損(P<0.05)

7、；(4)KO組超氧化物生成較WT組為高(P<0.05)，其NADPH氧化酶活性也明顯增強(P<0.01)。
　　[結論]醛固酮合成酶表達增加和主動脈內皮舒張功能受損可能是miRNA150-KO小鼠血壓升高的機制。
　　第二節(jié)，依普利酮短期干預實驗
　　[目的]觀察依普利酮(Eplereone，EPL)對miRNA150-KO小鼠血壓水平、主動脈內皮功能及氧化應激產物的影響，以進一步探討miRNA150-KO小鼠血壓發(fā)生

8、的可能機制。
　　[方法]miRNA150-KO小鼠(n=12)隨機分為DMSO組(KO-DMSO)和EPL組(KO-EPL)，(n=6)；WT小鼠分成DMSO組(WT-DMSO)和EPL組(WT-EPL)(n=6)。EPL組干預為50mg/Kg.day腹腔注射，連續(xù)干預5天。(1)觀察小鼠體重、尿量變化；(2)并觀察組織器官重量指數(shù)變化及血漿醛固酮水平變化；(3)DHE staining法觀察腎臟、主動脈超氧化物變化；(4)NA

9、DPH氧化酶活性變化情況；(5)免疫組化8-OHDG的表達；(6)EPL組對腎臟結構的保護作用。
　　[結果](1)EPL組(KO-EPL)血壓水平下降，較KO-DMSO為顯(P<0.01)；(2)EPL干預使KO組尿量增加(P<0.05)，而血漿醛固酮水平沒有顯著性變化；(3)EPL改善KO小鼠內皮功能(P<0.05)，并下調NADPH氧化酶活性(P<0.05)；(4)EPL減少腎臟和主動脈的超氧化物產生(P<0.05，P<0.

10、01)；(5)EPL促使8-OHDG表達降低。
　　[結論]依普利酮短期干預研究能降低KO小鼠血壓水平，抑制NADPH氧化酶活性，改善主動脈內皮功能，逆轉腎臟損害。
　　第三部分，衰老相關的腎臟損害因素分析
　　[目的]檢測在老年大鼠腎臟中klotho，內皮素(ET)受體和超氧化物的變化，以及是否這些變化在認知功能障礙的大鼠中是否加劇。
　　[方法]根據(jù)認知功能測試，將20只大鼠(雄性，27個月)隨機分為兩組，損

11、傷的老年大鼠組(n=9)和未損傷的老年大鼠組(n=11)。12個月齡大鼠(n=10)作為年輕未損傷組。采集血清ELISA測定血清肌酐和ET-1的濃度。采用PAS染色和三色染色評價腎組織學改變。DHE染色測定腎臟原位超氧化物。采用免疫組化和Western印跡檢測Klotho蛋白，內皮素受體ET，Nox2，IL-6，和MnSOD在腎皮質和髓質的表達。
　　[結果]認知功能損傷的老年大鼠組血清肌酐顯著增加(p<0.05)，提示腎功能受損

12、。老年大鼠出現(xiàn)腎小球硬化和小管間質性纖維化。認知功能損傷的老年大鼠組較認知功能未損傷的老年大鼠上述這些病理變化顯著的加劇(p<0.01)。老年大鼠腎皮質和髓質klotho蛋白表達顯著下降，IL-6，Nox2，ET-a受體和超氧化物超的表達增加，然而老年大鼠腎臟的線粒體超氧化物歧化酶(MnSOD)和ETb受體的表達明顯降低。認知功能損傷的老年大鼠組較認知功能未損傷的老年大鼠組上述這些變化更為明顯。
　　[結論]認知功能損傷的老年大鼠