模擬失重對大鼠承重骨骨組織細胞凋亡的影響.pdf

1、研究背景:地球上,正常人體的運動系統(tǒng)承受兩種刺激:重力(被動刺激)和運動(主動刺激)。兩者相結合、相互作用通過一系列生理、生化過程維持骨組織的結構來適應這種力學環(huán)境?？臻g飛行中的最重要環(huán)境特征之一就是微重力(失重)。失重是物體只表現(xiàn)為質(zhì)量而不表現(xiàn)為重量的特殊力學環(huán)境一微重力(10-6-10-9g)環(huán)境,是航空航天過程中人類必須面臨和克服的問題,已有的研究表明,失重可導致心血管系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等的生理甚至病理改變。研究認為,上述生

2、理變化的產(chǎn)生是失重通過感覺傳入信息變化、體液頭向轉移和重力負荷力學作用消失三個不同層次的生理效應發(fā)生作用。
　　 骨質(zhì)疏松是一種常見的代謝性骨病,以單位體積內(nèi)骨量減少,骨礦物質(zhì)沉積減少,而骨的成分含量不變?yōu)樘攸c。骨質(zhì)疏松分為原發(fā)性骨質(zhì)疏松與繼發(fā)性骨質(zhì)疏松。失重性骨質(zhì)疏松屬于繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的一種,是以力學因素為主所致的骨質(zhì)疏松。失重導致骨骼系統(tǒng)病理生理改變的相關研究表明,長期載人航天飛行中,航天員長時間生活在太空中,會因失重導致航

3、天員出現(xiàn)廢用性骨質(zhì)疏松。失重導致的廢用性骨質(zhì)疏松主要表現(xiàn)為骨量丟失、骨礦鹽含量下降、骨密度降低、骨生物力學性能下降,糞鈣和尿鈣排出量增加,血鈣升高,出現(xiàn)負鈣平衡。在失重環(huán)境,人體所發(fā)生的一系列適應性改變中,大部分系統(tǒng)的變化具有一定自限性,在航天飛行中會達到新的平衡狀態(tài),不再繼續(xù)發(fā)展,只有骨骼系統(tǒng)的變化呈現(xiàn)出進行性的過程,因此,長期的失重環(huán)境,骨礦鹽的持續(xù)丟失是航天飛行中人類所面臨的嚴重生理反應之一,也是妨礙人類長期太空停留和探索外星球的

4、主要障礙之一。航天醫(yī)學界非常重視失重條件下骨代謝的研究,雖然進行了大量的研究工作,但骨丟失的機理仍未闡明,雖已采取了各種防護措施,仍不能有效地防止失重環(huán)境下負重骨的骨丟失。由于國際空間站的建立、火星探測計劃的實施,人類在太空中停留的時間將進一步延長,如沒有有效的防護措施,骨的持續(xù)大量丟失,有可能導致高鈣血癥、腎結石、軟組織鈣化、病理性骨折等病理變化。因此,預防失重狀態(tài)下骨丟失的研究已成為國內(nèi)外航天醫(yī)學領域的重點和熱點。
　　 人

5、體的骨組織由骨祖細胞、骨細胞、成骨細胞、破骨細胞等構成。成骨細胞、骨細胞是骨組織中最重要的力學感受細胞,目前大量研究已證實,失重和模擬失重導致的骨丟失是一個以骨形成抑制起主導作用,并以成骨細胞數(shù)量減少、骨礦形成障礙和骨成熟延遲為特征的病理生理過程。由于微重力下成骨細胞、骨細胞等缺乏必要的機械力刺激,使其增殖和分化功能下降,導致成熟成骨細胞、骨細胞數(shù)量減少,骨形成下降,這是造成空間骨丟失的主要因為。目前關于失重性骨丟失的研究焦點和熱點主要

6、是成骨細胞、骨細胞對微重力的響應、信號傳導、基因表達和功能變化等。
　　 研究目的:建立大鼠尾部懸吊模擬失重模型,研究模擬失重對骨組織中細胞凋亡的影響,并從Fas/FasL途徑上探討失重引起骨組織中細胞凋亡的機制。
　　 研究方法:
　　 1、模型制備:5周齡雄性SD大鼠36只隨機分為(7d、14d及21d)尾吊模擬失重組和相應對照組；尾吊模擬失重組大鼠用透氣膠帶粘貼于尾部近2/3部兩側,透氣膠布遠端懸掛于自由滑

7、動的塑料環(huán),使大鼠呈頭低位,身體與地面呈30°,后肢自由懸空不負重；對照不予處理,于相同籠具等量飲食飼養(yǎng)。
　　 2、對各模型組大鼠反應的觀察:觀察尾吊期間大鼠活動、飲食、體重變化、皮毛尾部色澤；建模后7d、14d及21d取血清行骨代謝生化指標測量,取右側脛骨近端制備石蠟切片。
　　 3、骨代謝生化指標測量:利用美國杜邦(Dimension AR)全自動生化分析儀分別測血清鈣(偶氮胂Ⅲ法)、磷(磷鉬酸比色法)、堿性磷酸酶

8、(硝基苯磷酸二鈉比色法)。根據(jù)抗原與抗體競爭性結合的原理,嚴格按使用說明操作,用放免法在SN-697型放射免疫分析儀上測骨鈣素。
　　 4、骨組織原位細胞凋亡檢測:取右側脛骨近端制備石蠟切片,原位細胞凋亡檢測技術檢測骨組織中細胞凋亡。TUNEL(TdT—mediated dUTP nick endlabeling)技術原理是生物素標記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdTEnzyme)的作用下,可以連接到凋亡細胞或凋亡小體

9、中由核酸內(nèi)切酶切斷的DNA短鏈的3’末端缺口,并與連接過氧化酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)的鏈霉親和素特異性結合,后者可催化底物顯色,特異準確地定位正在凋亡的細胞,因而在光學顯微鏡下即可觀察凋亡細胞。
　　 5、骨組織Fas蛋白含量測定:取右側脛骨近端制備石蠟切片,免疫組織化學方法檢測骨組織中Fas蛋白含量。免疫組化是應用免疫學基本原理-抗原抗體反應,即抗原與抗體特異性結合的原理,通過化學反應使標記抗體的顯色劑(酶、金屬離子、

10、熒光素、同位素)顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì)),對其進行定位、定性及定量的研究。
　　 統(tǒng)計方法:所有數(shù)據(jù)采用(x)±s表示,用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,組間兩獨立樣本t檢驗、單向方差分析、重復測量方差分析及雙因素方差分析(析因分析)進行統(tǒng)計分析,LSD、SNK多重檢驗,當方差不齊時選用Dunnea's T3、Dunnett'sC多重檢驗,P<0.05為差異具有顯著性意義。
　　 研究結果:

11、　　 1、大鼠尾吊情況:尾吊期間大鼠活動、進食無受限,無反轉咬尾、尾部缺血壞死及感染現(xiàn)象,動物成活,懸吊3d后兩組大鼠體質(zhì)量基本保持穩(wěn)定增長。
　　 2、骨代謝生化指標測量:7d、14d、21d尾吊模擬失重組大鼠血清中ALP、BGP含量均顯著低于相應對照組,有統(tǒng)計學差異；但血Ca、P濃度均較相應對照組升高,7d模型組顯著升高,有統(tǒng)計學差異,14d及21d尾吊模擬失重組與相應對照組無統(tǒng)計學差異。
　　 3、骨組織原位細胞

12、凋亡檢測:正常對照組大鼠脛骨干骺端小梁骨區(qū)域(成骨區(qū))骨小梁排列規(guī)整、陽性染色(深棕色)細胞核數(shù)量少,而尾吊模擬失重組大鼠脛骨干骺端小梁骨區(qū)域(成骨區(qū))骨小梁變細、數(shù)量減少、排列紊亂、小梁間隙增寬,可見大量成骨細胞、骨細胞及骨髓間充質(zhì)細胞核呈陽性染色(深棕色)。各模型組骨組織中成骨細胞、骨細胞及骨髓間充質(zhì)細胞凋亡指數(shù)明顯高于相應對照組,有統(tǒng)計學差異,隨著尾吊時間延長,14d、21d模擬失重組骨組織中細胞凋亡指數(shù)比7d模擬失重組有所下降,

13、差異有統(tǒng)計學意義,而21d模擬失重組較14d模擬失重組骨組織中細胞凋亡指數(shù)有所下降,差異有統(tǒng)計學意義。
　　 4、骨組織Fas蛋白含量測定:大鼠骨組織Fas染色陽性細胞范圍廣泛,包括成骨細胞、骨細胞以及骨髓間充質(zhì)細胞,正常對照組大鼠脛骨干骺端小梁骨區(qū)域(成骨區(qū))骨小梁排列規(guī)整,僅有少量成骨細胞、骨細胞及骨髓間充質(zhì)細胞胞膜或胞漿呈陽性染色。尾吊模擬失重組脛骨干骺端小梁骨區(qū)域(成骨區(qū))骨小梁變細,數(shù)量減少,排列紊亂,小梁間隙增寬,可

14、見大量成骨細胞、骨細胞及骨髓間充質(zhì)細胞胞膜或胞漿呈陽性染色,且染色深。各模型組骨組織中Fas蛋白含量均高于相應對照組,有統(tǒng)計學差異,且隨著尾吊時間延長,模擬失重組中Fas蛋白表達有所減少,各組間有統(tǒng)計學差異。
　　 研究結論:
　　 1、本實驗所建立尾吊模擬失重環(huán)境大鼠模型,成功模擬了體液頭向轉移和負重骨脫負荷兩個失重對機體作用的主要生理效應,大鼠應激反應小,為地面模擬失重環(huán)境的研究提供了較好的動物模型；
　　

15、2、模擬失重環(huán)境影響骨代謝生化指標。血鈣升高,出現(xiàn)負鈣平衡。
　　 3、模擬失重環(huán)境大鼠骨組織中Fas蛋白的表達增加。
　　 4、模擬失重環(huán)境誘導骨組織中成骨細胞、骨細胞及骨髓間充質(zhì)干細胞的細胞凋亡。
　　 5、Fas蛋白的表達與成骨細胞、骨細胞凋亡率密切相關,由此推斷,模擬失重環(huán)境促進了Fas蛋白的表達,從而誘導了骨細胞、成骨細胞的凋亡。
　　 6、隨著尾吊模擬失重時間延長,骨組織中Fas蛋白表達及細胞