肝臟不同類型細胞基因表達及可變剪接的研究.pdf

1、肝臟是人體中最大的實質(zhì)性器官，主要負責著體內(nèi)脂類、糖類、蛋白質(zhì)、和維生素等眾多物質(zhì)的代謝，是人體中的代謝工廠。此外，肝臟在體內(nèi)還發(fā)揮著解毒、免疫、存儲糖原和維生素、合成膽汁以及造血等功能，被稱之為體內(nèi)最繁忙的器官。肝臟的復雜功能的發(fā)揮依賴于組成肝臟的各種類型的細胞，肝臟細胞主要分成兩類:肝實質(zhì)細胞(HC)和非實質(zhì)細胞(NPC)。前者是肝臟中最主要的細胞類型，占據(jù)肝臟體積約80％，發(fā)揮著肝臟中的絕大部分功能。非實質(zhì)細胞主要包括肝竇內(nèi)皮細胞

2、(LSEC)、枯否細胞(KC)、肝星狀細胞(HSC)以及其他一些免疫細胞等。目前，對肝臟細胞的研究往往集中于某一種類型的細胞。
　　本研究同時構(gòu)建了多種類型細胞的基因表達譜，通過肝臟細胞水平表達譜的全面解析，系統(tǒng)地發(fā)現(xiàn)肝臟細胞中表達的新基因或新亞型，深入地了解肝臟不同類型細胞的共性與特性，全新地認識細胞在肝臟器官中的分工與協(xié)作。
　　轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組作為基因組后繼補充研究對象，分別擔當傳遞遺傳信息和功能最終執(zhí)行的角色。而蛋白

3、質(zhì)組鑒定覆蓋度的范圍往往是參照編碼基因的數(shù)目，因此可尋求轉(zhuǎn)錄組水平的mRNA鑒定輔助蛋白質(zhì)組的深度覆蓋。除了覆蓋度的優(yōu)勢以外，轉(zhuǎn)錄組水平在靈敏度和準確性方面具有無可比擬的優(yōu)勢，還可以更精確地鑒定到基因的可變剪接、RNA編輯等信息。目前，轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)作為一項新一代測序技術(shù)，能在全基因組范圍內(nèi)以單堿基分辨率檢測并定量轉(zhuǎn)錄片段，成為研究轉(zhuǎn)錄組表達譜的重要方法。
　　首先，我們首次構(gòu)建了肝臟細胞水平的轉(zhuǎn)錄組表達譜。以C57

4、BL/6小鼠動物為模型，采用流式細胞術(shù)完成肝臟3種類型細胞（HC、LSEC和KC）的分選，確保各類細胞純度和活性分別達到95％和85％以上。對細胞提取的RNA，利用新一代測序RNA-Seq技術(shù)，每種類型細胞得到3G以上的數(shù)據(jù)量，滿足深度測序目的。通過數(shù)據(jù)低質(zhì)量過濾、讀段定位、轉(zhuǎn)錄本重構(gòu)、表達定量以及質(zhì)量控制等一系列的數(shù)據(jù)處理，完成了肝臟不同類型細胞轉(zhuǎn)錄組的定性和定量分析。在假發(fā)現(xiàn)率(FDR)5％的標準下，HC、LSEC和KC分別鑒定到了

5、8802、10789和10125個基因，其中細胞特異表達基因分別是504、851和498個?；虮磉_豐度的相關(guān)性分析顯示HC與肝臟組織之間的相關(guān)系數(shù)最高，兩類非實質(zhì)細胞之間相關(guān)次之。這體現(xiàn)了HC在肝臟細胞中占絕大部分比例的事實，是最能夠代表肝臟組織的細胞類型。
　　其次，基于肝臟細胞的轉(zhuǎn)錄組表達譜，我們完成了不同類型細胞系統(tǒng)的功能注釋分析。其一，我們將各細胞表達基因根據(jù)豐度分成低、中和高表達組。通過功能富集分析，不同類型細胞存在共

6、性:低表達組基因功能富集細胞粘附，基因集中于膜與細胞表面;中表達基因富集轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及RNA加工等，而高表達基因則在翻譯、蛋白轉(zhuǎn)運以及能量代謝方面。說明了細胞水平上參與同一生物學過程的基因其表達水平亦相似的普遍規(guī)律。其二，針對3種類型細胞顯著高表達基因作GO功能富集分析，結(jié)果顯示細胞顯著高表達基因能夠較好地表征各自細胞的生物學特性。例如，HC顯著富集于氧化還原反應、各種代謝過程;KC作為肝臟中的巨噬細胞，富集條目則集中在免疫應答、損

7、傷應答以及炎癥反應等;而LSEC內(nèi)血管發(fā)育、細胞分化調(diào)控與已報道的LSEC在肝再生中的重要作用相關(guān)。其三，細胞特異表達基因和共同表達基因在豐度分布和功能富集方面差異明顯。細胞特異基因偏向于低豐度，位于細胞表面和膜位置，功能集中于小分子代謝以及細胞特殊的一些生物學功能。而共同表達基因富集于大分子代謝過程，集中在胞內(nèi)亞細胞器分布。利用細胞特異表達基因進行通路富集分析，我們發(fā)現(xiàn)肝臟中很多生物學過程涉及不同類型細胞的協(xié)同作用。其四，各細胞內(nèi)基因

8、表達豐度的無監(jiān)督聚類結(jié)果揭示不同類型細胞具有顯著不同的基因表達模式，細胞富集表達的基因簇表明了各自的生物學特征。
　　再次，我們系統(tǒng)地鑒定了肝臟不同類型細胞內(nèi)的可變剪接以及細胞之間的可變剪接差異。HC、LSEC和KC即使都同屬于肝臟，但來源屬性均不同，HC屬于上皮細胞，LSEC為內(nèi)皮細胞，KC則是屬于髓系細胞。以肝臟細胞為代表，我們第一次解析了細胞水平的剪接差異，對于揭示不同細胞為完成各自功能選擇性表達不同剪接體具有重要意義。通過

9、RNA-Seq數(shù)據(jù)重新拼接組裝轉(zhuǎn)錄本，除了數(shù)據(jù)庫已知轉(zhuǎn)錄本的鑒定，我們還發(fā)現(xiàn)了20％以上的新轉(zhuǎn)錄本，對應著不同的可變剪接方式。在3種類型細胞中，外顯子跳躍均是最廣泛的剪接形式。新轉(zhuǎn)錄本的鑒定及部分驗證，豐富了對應基因的注釋。另外，通過不同細胞之間的可變剪接事件比較，我們首次發(fā)現(xiàn)肝臟細胞之間存在著大量“switching-like”的剪接差異，不同細胞對于同一基因偏好表達不同的可變剪接體，以滿足各細胞的功能需求。這一事實也得到了qPCR實

10、驗的證明。此外，我們嘗試從剪接因子的角度解釋了細胞之間剪接差異形成的可能原因。
　　最后，我們以肝臟組織為例，采取轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的整合策略，鑒定新蛋白產(chǎn)物，優(yōu)化了基因組注釋。我們同時產(chǎn)出了肝臟組織的RNA-Seq數(shù)據(jù)和質(zhì)譜數(shù)據(jù)。將轉(zhuǎn)錄組水平得到的可變剪接、RNA編輯和新編碼基因信息擴充至已知蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建了肝臟組織特異的個性化蛋白質(zhì)序列庫。經(jīng)過質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索，在FDR小于1％的水平下，我們共鑒定到150個薪肽段，對應7

11、2個新可變剪接體、15個RNA編輯位點以及43個可能的新編碼基因區(qū)。并且，隨機選取了11個新肽段對應的轉(zhuǎn)錄本均得到了PCR和傳統(tǒng)Sanger測序的證實。雙組學水平上發(fā)現(xiàn)并驗證的高可信新基因產(chǎn)物展示了我們方法的有效性。
　　綜上所述，我們首次構(gòu)建了肝臟不同類型細胞的轉(zhuǎn)錄組表達譜，這是目前基于細胞水平的最大的小鼠肝臟轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)，為研究肝臟細胞功能提供了一個全面的參考資源。通過對不同細胞轉(zhuǎn)錄組系統(tǒng)全面的功能富集分析，解析了肝臟不同類型