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文檔簡介
1、研究背景:由乙型肝炎病毒(HBV)引起的慢性乙型肝炎是我國常見的慢性傳染病之一,嚴重危害人民健康。以往研究表明,抗原特異性的CD8+細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)對體內(nèi)HBV的清除起關(guān)鍵作用。在乙肝患者體內(nèi),來源于HBV 相關(guān)抗原的、MHC-I 類分子限制性表位肽被認為是特異性CD8+CTL 識別病毒感染細胞的靶標。雖然慢性HBV 感染患者外周血中存在抗原肽特異性CTL,但這種病毒特異性CD8
2、+CTL的頻率及功能減低,是HBV 得以持續(xù)存在的一個重要原因。
因此,通過主動免疫方式增強HBV 相關(guān)抗原肽特異性CTL 反應,是治療慢性HBV感染的理想策略。既往對于病毒抗原表位肽的研究多針對單一主要組織相容性復合體(Major histocompatibility complex, MHC)限制性,缺乏覆蓋更多人白細胞抗原(humanleucocyte antigen,HLA)背景人群的治療性表位肽疫苗。HLA分子的
3、高度多態(tài)性與T細胞識別的MHC 限制性是研制廣譜高效表位肽疫苗的最大障礙。HLA 超型是指具有相同的肽結(jié)合特異性的不同HLA分子的總合。這一概念的提出,為基于HBV 相關(guān)抗原超型表位肽疫苗的設計提供了新的思路。
研究目的:本研究初步分析了慢性HBV 感染與HLA-A 超型的相關(guān)性,預測并初步鑒定了HLA-A3 超型限制性HBV 相關(guān)抗原特異性CTL表位肽,為基于超型表位的慢性HBV 感染的治療提供實驗基礎及新的候選靶標。<
4、br> 研究方法:分別從西南醫(yī)院肝炎門診和獻血中心收集慢性HBV 感染者及健康志愿者外周血,通過聚合酶鏈反應/序列特異性引物技術(shù)(PCR-SSP)對其HLA 型別進行檢測,分析慢性HBV 感染與HLA-A 超型之間的關(guān)系?;赟YFPEITHI、BIMAS、SVMHV、IEDB、EPIJEN、NETMHC 6個表位預測網(wǎng)站,分別預測出HLA-A3 超型各等位基因(HLA-A*0301、HLA-A*1101、HLA-A*3101、H
5、LA-A*3301、HLA-A*6801)
限制性表位,并對預測結(jié)果進行整合,預測出與HLA-A3 超型各等位基因具有高親和力的乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝核心抗原(HBcAg)候選表位肽。鑒于HLA 超型分子具有結(jié)合相同或相似表位肽的特點,并且在HLA-A3 超型中,HLA-A*1101分子表型頻率最高,因此,我們選擇首先鑒定候選超型表位肽HLA-A*1101限制性。在體外細胞功能試驗中,通過Elispot Assa
6、y 檢測候選表位肽誘導外周血單核細胞(PBMC)IFN-γ的分泌;胞內(nèi)因子染色流式細胞術(shù)分析表位肽特異性CD8+CTL IFN-γ及GranB的分泌;CFSE 標記檢測表位肽誘導的特異性CD8+CTL的增殖;Pentamer染色流式細胞術(shù)分析法檢測HLA-A*1101健康志愿者PBMC經(jīng)肽誘導后所產(chǎn)生的特異性CD8+CTL 頻率,以及慢性HBV 感染患者外周血表位肽特異性CD8+CTL的頻率。
最后通過Elispot as
7、say 初步鑒定候選表位肽對其他HLA-A3 超型等位基因的健康人PBMC 所產(chǎn)生的誘導效應。
研究結(jié)果:在我們收集的44例來自西南醫(yī)院獻血中心的健康志愿者中,HLA-A3超型為主要HLA-I 類分子超型基因,其中以HLA-A*1101頻率最高,在49例慢性HBV感染者中,HLA-A2 超型為最高頻超型等位基因。結(jié)合多個在線表位預測網(wǎng)站,采用整合法預測的超型表位兼顧了與HLA-A3 超型全部等位基因具有高親和力的表位(P5
8、,P6, P7, P8, P9)。根據(jù)應答指數(shù)以及胞內(nèi)因子染色結(jié)果證實五條候選表位肽均能在體外誘導HLA-A*1101健康人外周血表位肽特異性CD8+CTL 增殖并分泌IFN-γ和GranB。在HLA-A*1101陽性的慢性HBV 感染患者中,P7 肽誘導產(chǎn)生的特異性CD8+CTL 頻率明顯高于已知的陽性表位P6 肽。五條候選超型表位肽均可以誘導帶有HLA-A3 超型等位基因個體的PBMC分泌IFN-γ,但是對同屬于HLA-A3 超型的
9、不同HLA等位基因,其限制性CTL分泌IFN-γ的能力存在差異。
研究結(jié)論:結(jié)合本研究中各部分的實驗結(jié)果,HLA-A3 超型在人群中分布頻率最高,同時,HLA-A*1101是HLA-A3 超型中最高頻等位基因。利用整合法預測的5 條HBV 相關(guān)抗原候選表位,經(jīng)初步鑒定為HLA-A3 超型限制性CTL表位。而且,從表位肽特異性CTL的頻率與功能水平上分析,較目前已知的HLA-A*1101限制性陽性表位肽(P6),P7 肽是一
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