水稻白葉枯菌OS198中兩個tal基因的克隆及功能分析.pdf

1、水稻白葉枯病是水稻上最重要的細菌病害之一，它是由稻黃單胞桿菌水稻致病變種（Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo）引起的。在Xoo中轉錄激活類似效應蛋白（Transcription activator-like effectors，TALEs）是通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)分泌到寄主水稻中的一類泌出蛋白，其編碼基因為tal基因。在Xoo中，tal基因的研究主要集中于已經測序的幾個菲律賓、日本和韓國菌株上，中國菌

2、株上報道的有avr/pthC8a，它為C8菌株中的一個無毒基因。挖掘新的tal基因、解析其功能是揭示病原細菌致病分子機制的基礎，并為進一步進行水稻抗白葉枯病的遺傳工程提供理論依據和基因資源。
　　OS198是水稻白葉枯菌中國系統(tǒng)6號小種的代表菌株。它在多個水稻品種上（包括國際水稻所的近等基因系上）都表現為弱毒力。為了解該菌株的致病性分子遺傳機制，我們對OS198基因文庫克隆pUF369和pUF377中，經SphⅠ酶切后大小分別為3

3、.2 kb和2.6kb的tal基因進行了克隆和生物學功能分析。
　　凝膠回收pUF369中3.2 kb的SphⅠ酶切片段和pUF377中2.6kb的SphⅠ酶切片段，將其分別克隆到tal基因的克隆骨架載體pZW上，獲得含完整tal基因克隆pzw369-3.2、pzw377-2.6，將其線性化后連接到黃單胞菌表達載體pHM1上，獲得的重組質粒分別命名為pHZ369、pHZ377。
　　采用Tn5離體插入pzw369-3.2和p

4、zw377-2.6，篩選tal基因被插入突變的克隆，利用Tn5末端的兩個反向引物對突變體進行測序，測序序列拼接后獲得tal基因的完整序列。pzw369-3.2中tal基因序列拼接后命名為talR26.5(NCBI登錄號為KJ192237.1)。 talR26.5基因全長4452 bp，編碼1483個氨基酸。兩個BamHI位點之間序列大小為4281 bp。 Blast分析發(fā)現，TALR26.5與菲律賓菌株PXO357中的AvrXa7-3M

5、和日本菌株MAFF311018中的YP451895蛋白在氨基酸序列上具有99％的一致性，34個氨基酸重復區(qū)域相同，在C端和N端有5個氨基酸的差異。pzw377-2.6序列拼接后命名為talR20.5(NCBI登錄號為KJ192238)，talR20.5基因全長3819bp，編碼1272個氨基酸，兩個BamHI位點之間序列大小為3648 bp。Blast分析發(fā)現，TALR20.5與日本菌株MAFF311018中的YP451156蛋白具有9

6、8％的一致性，它們N端氨基酸序列相同，在第1，8，9，20重復區(qū)域共有9個氨基酸的差異，C末端有11位氨基酸的差異，且有三個重復區(qū)的RVD不一樣，所以talR20.5是一個新的tal基因。
　　將pHZ369、pHZ377分別導入PXO99A菌株中，測定了重組菌PXO99A/pHZ369和PXO99A/pHZ377在26個品種苗期水稻上的致病力。結果發(fā)現，與PXO99A相比，PXO99A/pHZ369在23個品種的水稻上致病力都沒

7、有差異，而在IRBB8、IRBB14和IRBB214三個品種水稻上致病力顯著降低;PXO99A/pHZ377在水稻IRBB50上的致病力和水稻葉片中的生長能力顯著下降。但與OS198相比，無論是病斑長度，還是病原菌的數量，PXO99A/pHZ369、PXO99A/pHZ377處理都顯著高于OS198。運用半定量RT-PCR分析接種PXO99A/pHZ369、PXO99A/pHZ377后水稻感病基因Os8N3的表達情況發(fā)現，注射接種24

8、h后，PXO99A/pHZ369、PXO99A/pHZ377對水稻感病基因Os8N3的誘導表達與PXO99A相比降低。
　　在非寄主植物本氏煙上接種，發(fā)現OS198引起HR面積大且癥狀明顯，PXO99A/pHZ369、PXO99A/pHZ377激發(fā)HR的能力比PXO99A明顯增強，對接種葉片進行trypan blue染色觀察接種部位，發(fā)現與PXO99A相比，PXO99A/pHZ369誘導煙草葉片細胞死亡數明顯增多。
　　以上