蘿卜鉛(Pb)脅迫響應的分子機制研究.pdf

1、重金屬污染嚴重影響蔬菜作物產量與品質，通過食物鏈會嚴重威脅人類健康。鉛(Pb)是最有毒的重金屬之一，容易被植物所吸收、并在不同的部位積累。蘿卜(Raphanus sativus L.)是一種主要以膨大的肉質根為食用器官的蔬菜作物，其肉質根容易受到Pb等重金屬的影響，因此研究蘿卜對重金屬的脅迫響應機制和遺傳調控網(wǎng)絡顯得極為重要。前人在蘿卜Pb吸收累積、轉運和脅迫響應生理生化變化等方面已進行相關研究，但對蘿卜Pb脅迫響應的分子機制尚不清楚。

2、鑒定出蘿卜Pb脅迫響應的功能基因、蛋白或代謝物是闡明其脅迫響應分子機制的重要基礎。本研究以蘿卜高代自交系‘NAU-RG’為試材，采用基于新一代測序技術的RNA測序(RNA-seq)對蘿卜肉質根進行轉錄組de novo測序，并且從轉錄組、蛋白組與代謝組水平等方面系統(tǒng)研究蘿卜重金屬Pb脅迫響應的分子機制。主要研究結果如下:
　　1.為了獲得較為全面的蘿卜肉質根轉錄組數(shù)據(jù)，利用Solexa Illumina平臺對不同發(fā)育階段（包括幼苗期

3、、破肚期和成熟期）的肉質根進行混樣，構建了一個cDNA文庫(‘CKA’)進行雙末端測序。共獲得約66.11M clean reads數(shù)據(jù)，通過拼接得到73，084條unigenes，其中N50為1，095 bp，總長度為55.73 Mb。對所得到的unigenes與NCBInon-redundant(NR)、Gene Ontology(GO)、Clusters of Orthologous Group(COG)和Kyoto Encycl

4、opedia of Genes and Genomes(KEGG)等公共蛋白數(shù)據(jù)庫進行相似性比對，共有67，305條unigenes(占總數(shù)92.09％)得到了功能注釋。這些unigenes主要參與基本生理和代謝過程，次生代謝物的生物合成途徑、信號轉導和其它一些與細胞成分、分子功能相關的過程。所獲得的轉錄組數(shù)據(jù)為研究蘿卜肉質根中相關性狀形成的分子機理和特定響應過程中關鍵基因分離鑒定提供了重要信息基礎。
　　2.為了在mRNA水平上

5、分離鑒定Pb脅迫響應網(wǎng)絡中差異表達基因，通過構建對照組(CK)和處理組(Pb1000)蘿卜肉質根RNA文庫，利用高通量測序技術進行了蘿卜Pb脅迫響應的差異基因表達譜分析。共獲得4，614個顯著的差異表達基因(DEGs)，包括2，154個上調表達和2，460個下調表達基因。GO和pathway富集分析表明，Pb脅迫上調表達的差異基因主要參與細胞壁的防御響應、谷胱甘肽代謝相關的生化過程，而下調表達的差異基因則主要參與碳水化合物代謝相關途徑。

6、利用qRT-PCR技術對22個差異基因進行表達模式驗證，發(fā)現(xiàn)與RNA-seq分析結果高度一致。此外，成功鑒定出多個參與防御和解毒機制的候選基因，包括編碼信號感知轉導蛋白激酶、轉錄因子、金屬轉運蛋白及合成螯合物相關酶的基因。
　　3.為系統(tǒng)分離鑒定蘿卜肉質根中Pb脅迫響應的miRNA及其靶基因，構建了對照組(CK)和處理組(Pb500)蘿卜肉質根sRNA文庫。通過應用Solexa測序共鑒定到74個已知miRNA和173個新型miRN

7、A。其中，有25個已知的和9個新型miRNA被鑒定為Pb脅迫響應miRNA?；谔}卜參考基因組序列的降解組分析，共得到1，979個miRNA-mRNA靶向轉錄本。GO分析表明，這些靶向轉錄本主要參與轉錄調控、防御響應和與結合有關的過程。同時鑒定的Pb脅迫響應miRNA的靶基因主要參與逆境相關的信號感知、轉導和相關次級代謝途徑，及與金屬離子吸收和體內轉運機制，包括激活多種金屬轉運蛋白和調節(jié)相關的轉錄因子。
　　4.運用蛋白組學iTR

8、AQ技術對Pb500和Pb1000脅迫下蘿卜肉質根蛋白質組變化進行分析。在95％的置信區(qū)間內共鑒定到3，898個蛋白，對2，141個蛋白進行定量分析。2種Pb處理的差異蛋白有部分重疊，共有721個蛋白在至少一種Pb脅迫處理中差異表達，135個蛋白在Pb500與Pb1000處理下均顯示差異表達。GO和pathway富集分析表明，135個共同差異表達蛋白主要參與細胞結構組分變化、碳水化合物和能量代謝相關的代謝途徑和抗氧化防御。此外，將蘿卜P

9、b脅迫下蛋白水平與轉錄水平的相關數(shù)據(jù)進行關聯(lián)分析，有77.3％可鑒定蛋白和和77.9％的可定量蛋白在轉錄水平被關聯(lián)到，但其表達豐度變化卻呈現(xiàn)出極低的相關性。
　　5.應用GC-MS技術對Pb脅迫下蘿卜肉質根的代謝物組分進行分析。對照組(CK)和處理組(Pb1000)在主成分分析(PCA)和偏最小二乘方判別分析(PLS-DA)中均可明顯區(qū)分，采用PLS-DA模型第一主成分的VIP(Variable Importance in the