降鈣素基因相關肽對成骨細胞一氧化氮信號通路調控的實驗研究-.pdf

1、周圍神經所分泌的神經肽類物質對骨折修復重建和骨代謝具有重要生物學調控作用，部分神經肽類物質的促成骨作用在體內外實驗中分別得以證實。降鈣素基因相關肽（Calcitonin gene related peptide， CGRP）是其中研究較為詳盡的一類，自從在骨痂中發(fā)現(xiàn)CGRP 陽性神經纖維表達開始，體內實驗通過轉基因小鼠和基因敲除小鼠證明了CGRP的促成骨效應，體外實驗也發(fā)現(xiàn)了成骨細胞表面有CGRP 受體存在，證實了CGRP 促進成骨細胞

2、(Osteoblast，OB) 增殖的生物學效應，并發(fā)現(xiàn)了其下游的環(huán)磷酸腺苷(Cyclic Adenosine monophosphatec, cAMP)，細胞內游離鈣離子(Intracellular Ca 2+， [Ca 2+]I)和絲裂原激活激酶(Mitogen-activated protein kinase MAPK)等信號通路。
　　 一氧化氮(Nitric oxide, NO)作為一種信號傳導分子，是人體內常見的第二

3、信使，研究證明NO能促進骨折愈合初期的血管生成，調節(jié)成骨細胞及破骨細胞活性，但目前尚無研究證明NO是否參與到CGRP對成骨細胞的調控信號通路中。體內試驗發(fā)現(xiàn)一氧化氮合成酶(Nitric oxide synthase, NOS)的內皮型NOS(endotheliAlNOS, eNOS)，神經元型nNOS(neuronAlNOS, nNOS)和誘導型NOS(inducible NOS, iNOS)三類亞型在骨折愈合過程中的不同時期均有表達，

4、各自發(fā)揮不同的生理作用。人體對NO 生成的調控主要通過以下兩種方式進行，一是通過調節(jié)細胞內結構型NOS(constitutive NOS, cNOS)的酶活力，包括了eNOS和nNOS，二是通過調節(jié)iNOS基因表達，調節(jié)細胞內NO濃度。不同濃度的NO對成骨細胞有截然相反的生物學作用，cNOS 所合成的持續(xù)低濃度的NO 可以促進成骨細胞的增殖和骨基質分泌功能，同時促進前體破骨細胞向破骨細胞轉換和提高破骨細胞的細胞活性。由細胞炎癥因子所誘導

5、iNOS 產生的較高濃度NO對細胞有明顯的細胞毒性作用，高濃度的NO 則會抑制成骨細胞DNA 合成、Ⅰ型膠原蛋白(Collegen）Ⅰ、骨鈣素(Osteocalcin, OC)產生和堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)活性等。
　　 本實驗旨在通過體外培養(yǎng)成骨樣細胞株MG-63，驗證CGRP對MG-63細胞的增殖分化的生物學作用；在明確CGRP對MG-63細胞的生物學作用的基礎上，探討CGRP對NOS

6、酶活力和蛋白表達的調控，以及該調控對細胞NO 生成的作用；在明確CGRP與NO 生成的相關性后，探討CGRP對NO 生成的調控機制；最后探討MG-63細胞中CGRP-NO 調控的生物學意義。
　　 方法：
　　 1.細胞培養(yǎng)：人骨肉瘤細胞MG-63細胞株購買于ATCC 公司，以5×106/瓶密度接種于100ml 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)傳代，加入含10％ FCS的高糖DMEM 培養(yǎng)基，置于5％ CO2孵箱中37°C 孵育72 或96

7、h 傳代，6-8代細胞用于實驗。
　　 2.CGRP對MG-63細胞增殖和分化的作用：
　　 2.1增殖：MTT 法檢測CGRP對MG-63細胞增殖的量效作用(10-10-10-7 mol/L)和時效作用(24-96 h)；流式細胞儀檢測10-8 mol/L濃度的CGRP對MG-63細胞周期的時效作用(0-24 h)；RT-PCR 檢測10-8 mol/L濃度的CGRP對MG-63的c-fos/c-jun mRNA表達時

8、效作用(0-80m)；
　　 2.2分化：改良Kaplow 氏法檢測CGRP對MG-63細胞ALP 染色的量效作用(10-10-10-7 mol/L)；茜素紅染色檢測CGRP對MG-63 鈣化結節(jié)的量效作用(10-10-10-7 mol/L)；
　　 RT-PCR 檢測CGRP對MG-63細胞 Collagen ⅠmRNA表達的量效作用(10-10-10-7 mol/L)；ELISA 檢測CGRP對MG-63細胞OC表達

9、的量效作用(10-10-10-7 mol/L)。
　　 3.CGRP對MG-63細胞NO的調控作用：
　　 Griess 法檢測10-8 mol/L的CGRP對MG-63細胞培養(yǎng)液中NO濃度時效作用(0-48h)；激光共聚焦DAF-FM DA 熒光檢測10-8 mol/L的CGRP對MG-63細胞中NO濃度時效作用(0-4 h)；NOS 酶活力試劑盒檢測10-8 mol/L的CGRP在作用1h后對MG-63細胞eNOS、

10、nNOS和iNOS 亞型酶活力的調控作用；免疫熒光檢測10-8 mol/L的CGRP對MG-63細胞中eNOS、nNOS和iNOS 亞型表達的時效作用(0-48 h)。
　　 4.CGRP對MG-63細胞NO的調控機制：
　　 4.1CGRP通過[Ca 2+]I對MG-63細胞eNOS 酶活力的調控：
　　 激光共聚焦Fluo-3/AM 熒光檢測10-8 mol/L的CGRP對MG-63細胞中[Ca 2+]I的時

11、效作用(0-15 m)；激光共聚焦DAF-FM DA 熒光檢測L 型Ca 2+通道抑制劑verpamil對CGRP 誘導的細胞內NO濃度增高的抑制作用；Griess 法檢測verpamil對CGRP 誘導的細胞培養(yǎng)液中NO濃度增高的抑制作用。
　　 4.2 CGRP對MG-63細胞iNOSmRNA表達的調控作用：
　　 ReAltime PCR 檢測CGRP對MG-63 iNOS mRNA表達的時效作用(0-48 h)；

12、ReAltime PCR 檢測，在炎癥因子TNF-α和INF-γ誘導下CGRP對MG-63 iNOS mRNA表達的作用。
　　 5. MG-63中CGRP-NO 調控作用的生物學意義：
　　 5.1增殖：MTT 法檢測eNOS 抑制劑，50umol/L的L-NAME對MG-63細胞增殖的時效作用(24-96 h)；MTT 法檢測L-NAME對CGRP 誘導的MG-63 促增殖效應的抑制作用；流式細胞儀檢測L-NAME對

13、CGRP 誘導MG-63細胞周期改變抑制作用；Realtime PCR 檢測L-NAME對CGRP 誘導MG-63細胞c-fos/c-jun mRNA表達改變的抑制作用。
　　 5.2分化：ReAltime PCR 檢測L-NAME對CGRP 誘導MG-63細胞Collagen ⅠmRNA表達表達改變的抑制作用；ELISA 檢測L-NAME對CGRP 誘導MG-63細胞OC表達改變的抑制作用結果。
　　 結論
　　

14、 1.CGRP對MG-63細胞具有顯著的促增殖效應，以10-8 mol/L濃度作用最為明顯；
　　 CGRP對MG-63的促增殖效應體現(xiàn)在激活AP-1的c-fos mRNA表達，加速細胞進入有絲分裂期，從而提高細胞增殖指數；CGRP 促進MG-63細胞分化，細胞ALP 染色、礦化結節(jié)形成、Collagen ⅠmRNA表達及OC分泌均有顯著提高。
　　 2.CGRP能夠激活MG-63細胞eNOS 酶活力，升高細胞內NO濃

15、度，從而使培養(yǎng)液中NO 產物濃度增加；CGRP對MG-63細胞的NOS 各亞型的蛋白表達無明確的調控作用。
　　 3.CGRP對細胞NO的上調作用主要是通過增加細胞內的[Ca 2+]I，激活細胞eNOS 酶活力所完成的，而與iNOS mRNA表達調控無關；CGRP對在炎癥因子誘導下MG-63細胞iNOS mRNA表達無調控作用。
　　 4.通過抑制細胞內eNOS 酶，有效抑制了CGRP對MG-63細胞c-fos mRNA