環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法快速檢測(cè)艱難梭菌毒素基因.pdf

1、艱難梭菌（Clostridium difficile，C.difficile）是革蘭氏陽(yáng)性厭氧芽孢桿菌，本身無(wú)侵襲性。當(dāng)機(jī)體腸道內(nèi)環(huán)境受到破壞時(shí)，部分產(chǎn)毒性艱難梭菌通過(guò)分泌毒素A、B以及二元毒素引起抗生素相關(guān)性腹瀉、結(jié)腸炎甚至偽膜性腸炎，統(tǒng)稱(chēng)為艱難梭菌感染(C.difficile infection，CDI)。據(jù)報(bào)道，隨著艱難梭菌高毒力菌株(BI/NAP1/027型)的出現(xiàn)，艱難梭菌感染的發(fā)病率和死亡率均顯著升高，引起全球的關(guān)注。

2、>　　艱難梭菌可分為產(chǎn)毒株和不產(chǎn)毒株，不產(chǎn)毒株不引起臨床癥狀。艱難梭菌產(chǎn)毒株主要分泌毒素A和毒素B，分別由tcdA和tcdB編碼。毒素A又稱(chēng)腸毒素，容易使腸壁中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，釋放淋巴因子，引起機(jī)體液體大量分泌和出血性壞死;毒素B又稱(chēng)細(xì)胞毒素，能使肌動(dòng)蛋白解聚，損壞細(xì)胞骨架，導(dǎo)致細(xì)胞固縮壞死，直接損傷腸壁細(xì)胞。毒素B的毒力較毒素A強(qiáng)10倍。
　　在歐洲和北美洲引起廣泛暴發(fā)流行的艱難梭菌高毒力菌株(BI/NAP1/027型)除分泌毒素

3、A和毒素B外，還分泌毒力更強(qiáng)的二元毒素(C.difficilebinary toxin，CDT)。CDT由致病性決定區(qū)外的2個(gè)染色體基因cdtA和cdtB編碼。cdtA是一種ADP核糖轉(zhuǎn)移酶，通過(guò)阻斷肌動(dòng)蛋白片段的合成，誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞死亡。cdtB是一種運(yùn)輸?shù)鞍祝唤z氨酸蛋白酶激活后，cdtB通過(guò)與宿主細(xì)胞結(jié)合，把cdtA轉(zhuǎn)移至細(xì)胞液中，誘導(dǎo)細(xì)胞骨架解聚，生成微管突出物，增強(qiáng)艱難梭菌的定植。
　　環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-med

4、iated isothermal amplification，LAMP），即針對(duì)靶基因6-8個(gè)特定區(qū)域設(shè)計(jì)4-6條特異引物，恒溫(63-67℃)時(shí)，鏈置換DNA合成在BstDNA聚合酶的作用下，通過(guò)自我循環(huán)合成大量目的DNA并產(chǎn)生白色沉淀，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的快速檢測(cè)。該方法檢測(cè)時(shí)間短(30-60min)，無(wú)需特殊儀器，操作簡(jiǎn)便，配合相應(yīng)顯色試劑還能實(shí)現(xiàn)肉眼判別結(jié)果。目前，LAMP方法已成功應(yīng)用于細(xì)菌、病毒及寄生蟲(chóng)的定性和定量檢測(cè)、胎兒

5、性別鑒定等，已成為臨床常用的快速檢驗(yàn)方法。
　　目的：
　　本研究旨在建立一種在恒溫條件下，快速、靈敏、特異、可視化、同步檢測(cè)艱難梭菌A、B毒素基因或同步檢測(cè)艱難梭菌二元毒素基因的方法，適用于基層醫(yī)療衛(wèi)生單位及各疾病預(yù)防控制中心篩查和檢測(cè)艱難梭菌及其高毒力菌株，為艱難梭菌的檢測(cè)及毒素分型提供新的技術(shù)平臺(tái)，有利于控制艱難梭菌感染的流行，指導(dǎo)臨床診療。
　　方法：
　　研究對(duì)象:2013年8月1日-2014年1月31

6、日期間，收集156例在南方醫(yī)院住院及門(mén)診腹瀉患者的新鮮糞便標(biāo)本（布里斯托分類(lèi)5-7級(jí)），并檢測(cè)標(biāo)本艱難梭菌A、B毒素基因及二元毒素基因的攜帶情況。排除33例糞便標(biāo)本（23例重復(fù)標(biāo)本、10例糞便量太少或不滿(mǎn)足新鮮糞便標(biāo)本要求），剩余123例為適合本研究的糞便標(biāo)本。
　　研究方法及內(nèi)容:1）.環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法快速檢測(cè)艱難梭菌AB毒素基因。①引物的設(shè)計(jì):通過(guò)BLAST軟件分別針對(duì)艱難梭菌tcdA與tcdB重復(fù)序列進(jìn)行同源性分析，獲得其特

7、異性保守序列，并將目標(biāo)DNA分為6-8個(gè)獨(dú)立區(qū)域，用軟件Primer design V4針對(duì)該6-8個(gè)獨(dú)立區(qū)域設(shè)計(jì)分別得到用于對(duì)艱難梭菌tcdA與tcdB進(jìn)行LAMP檢測(cè)的引物。②最佳引物篩查:通過(guò)對(duì)各組引物擴(kuò)增效率的對(duì)比得出最佳引物組合。③最佳反應(yīng)溫度篩查:以艱難梭菌標(biāo)準(zhǔn)株VPI10463的DNA提取液作為模板，分別設(shè)置58℃-69℃12個(gè)溫度梯度對(duì)最佳引物進(jìn)行擴(kuò)增，比較其擴(kuò)增效率找出最佳反應(yīng)溫度。④敏感性實(shí)驗(yàn):以艱難梭菌標(biāo)準(zhǔn)株VPI

8、10463的DNA提取液作為模板，用去離子水進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)瑵舛葟?07 ng/μl到0.000207 pg/μl，分別用LAMP，PCR方法檢測(cè)，比較兩者敏感性。LAMP法同時(shí)使用實(shí)時(shí)濁度儀和鈣黃綠色法判讀結(jié)果。⑤特異性實(shí)驗(yàn):用艱難梭菌標(biāo)準(zhǔn)株VPI10463作為陽(yáng)性對(duì)照，去離子水作為陰性對(duì)照，分別用艱難梭菌tcdA與tcdB的最佳引物擴(kuò)增26株常見(jiàn)致病菌，分別用LAMP，PCR方法檢測(cè)。LAMP法同時(shí)使用實(shí)時(shí)濁度儀和鈣黃綠色法判讀

9、結(jié)果。⑥糞便標(biāo)本檢測(cè):對(duì)比LAMP法、PCR法和基因測(cè)序法檢測(cè)123份糞便標(biāo)本tcdA攜帶情況，以及對(duì)比LAMP法、PCR法和細(xì)胞毒素中和試驗(yàn)檢測(cè)糞便標(biāo)本中艱難梭菌B毒素的攜帶情況。
　　2).環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法快速檢測(cè)艱難梭菌二元毒素基因。①引物的設(shè)計(jì):通過(guò)BLAST軟件分別針對(duì)艱難梭菌二元毒素基因cdtA與cdtB重復(fù)序列進(jìn)行同源性分析，獲得其特異性保守序列，并將目標(biāo)DNA分為6-8個(gè)獨(dú)立區(qū)域，用軟件Primer design

10、V4針對(duì)該6-8個(gè)獨(dú)立區(qū)域設(shè)計(jì)分別得到用于對(duì)艱難梭菌cdtA與cdtB進(jìn)行LAMP檢測(cè)的引物。②最佳引物篩查:通過(guò)對(duì)各組引物擴(kuò)增效率的對(duì)比得出最佳引物組合。③最佳反應(yīng)溫度篩查:以艱難梭菌標(biāo)準(zhǔn)株VPI10463的DNA提取液作為模板，分別設(shè)置57℃-64℃8個(gè)溫度梯度對(duì)艱難梭菌cdtA最佳引物進(jìn)行擴(kuò)增、設(shè)置57℃-68℃12個(gè)溫度梯度對(duì)艱難梭菌cdtB最佳引物進(jìn)行擴(kuò)增，比較其擴(kuò)增效率找出最佳反應(yīng)溫度。④敏感性實(shí)驗(yàn):以艱難梭菌標(biāo)準(zhǔn)株VPI1

11、0463的DNA提取液作為模板，用去離子水進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)瑵舛葟?4.8ng/μl到0.000248pg/μl，分別用LAMP，PCR方法檢測(cè)，比較兩者敏感性。LAMP法同時(shí)使用實(shí)時(shí)濁度儀和鈣黃綠色法判讀結(jié)果。⑤特異性實(shí)驗(yàn):用艱難梭菌標(biāo)準(zhǔn)株VPI10463作為陽(yáng)性對(duì)照，去離子水作為陰性對(duì)照，分別用艱難梭菌二元毒素基因cdtA與cdtB的最佳引物擴(kuò)增25株常見(jiàn)致病菌，分別用LAMP，PCR方法檢測(cè)。LAMP法同時(shí)使用實(shí)時(shí)濁度儀和鈣黃綠

12、色法判讀結(jié)果。⑥糞便標(biāo)本檢測(cè):對(duì)比評(píng)價(jià)LAMP法和PCR法檢測(cè)123份糞便標(biāo)本艱難梭菌cdtA與cdtB的攜帶情況。
　　結(jié)果：
　　1).LAMP法檢測(cè)艱難梭菌毒素特異基因tcdA的最佳引物是A12，最佳反應(yīng)條件是:61℃，反應(yīng)60min。LAMP法檢測(cè)艱難梭菌毒素特異基因tcdB的最佳引物是B0，最佳反應(yīng)條件是:60℃，反應(yīng)60min。同步檢測(cè)tcdA及tcdB的最佳反應(yīng)條件是:60℃，反應(yīng)60min。LAMP法只擴(kuò)增攜

13、帶tcdA或tcdB基因的艱難梭菌，特異性良好。LAMP法對(duì)艱難梭菌毒素特異基因tcdA及tcdB的最低檢出限均為20.7pg/μl，靈敏度為PCR法的10倍（PCR為207pg/μl）。基因測(cè)序法檢測(cè)123例糞便標(biāo)本，艱難梭菌tcdA的陽(yáng)性率為29.3％(36/123)，雖然LAMP法與PCR法的特異度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是LAMP法的靈敏度、與基因測(cè)序的一致百分率均較PCR法高?！敖饦?biāo)準(zhǔn)”-細(xì)胞毒素中和試驗(yàn)檢測(cè)123例糞便標(biāo)本，艱難梭菌

14、B毒素的陽(yáng)性率為25.2％,而LAMP法與PCR法檢測(cè)糞便標(biāo)本艱難梭菌B毒素的靈敏度、特異度均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2).LAMP法檢測(cè)艱難梭菌二元毒素cdtA基因的最佳引物是A2，最佳反應(yīng)條件是:60℃恒溫90min;檢測(cè)cdtB的最佳引物是B4，最佳反應(yīng)條件是:63℃恒溫90min;同步檢測(cè)cdtA和cdtB的最佳反應(yīng)條件為:61℃恒溫90min。LAMP法只擴(kuò)增攜帶cdtA和cdtB基因的艱難梭菌，特異性良好。LAMP法對(duì)艱難