高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒及其疫苗毒株JXA1-R熒光RT-PCR鑒別檢測(cè)方法的建立.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是以母豬生殖障礙和各種日齡豬（尤其仔豬）的呼吸道癥狀為主要特征的急性、高度接觸性傳染病，該病病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)。2006年之前我國(guó)主要的流行毒株是經(jīng)典PRRSV，2006年出現(xiàn)了高致病性PRRSV(HP-PRRSV)感染和流行。目前，預(yù)防HP-PRRSV感染的主要措施是接種疫苗，疫苗的種類有JXA1-R、HuN4-F112及TJM-F92，其中，JXA1-R株應(yīng)用最為廣泛。本研究成功

2、建立了HP-PRRSV野毒及其疫苗毒株JXA1-R雙重?zé)晒釸T-PCR鑒別檢測(cè)方法，其主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.HP-PRRSV野毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法的建立
　　根據(jù)GenBank中的經(jīng)典PRRSV及HP-PRRSV野毒株全基因序列的比較結(jié)果，在HP-PRRSV nsp2基因設(shè)計(jì)了一對(duì)引物和一個(gè)探針，建立了HP-PRRSV的熒光RT-PCR檢測(cè)方法。該方法敏感性達(dá)4.43拷貝/μL，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.998;用三

3、份不同稀釋濃度的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估，該方法具有良好的重復(fù)性，組內(nèi)變異系數(shù)為0.39％-0.96％，組間變異系數(shù)為1.1％-2.6％;用建立的方法同時(shí)檢測(cè)經(jīng)典PRRSV、HP-PRRSV野毒、PCV、PEDV、PRV、TGEV，只有HP-PRRSV野毒有特異性的熒光曲線，表明該方法的特異性好;該方法的檢測(cè)靈敏度為普通RT-PCR的1000倍。
　　2.JXA1-R疫苗毒株熒光RT-PCR檢測(cè)方法的建立
　　

4、根據(jù)HP-PRRSV與JXA1-R株的基因序列比較結(jié)果，設(shè)計(jì)一對(duì)引物和一個(gè)探針，建立了JXA1-R株熒光RT-PCR檢測(cè)方法。該方法靈敏度達(dá)8.25拷貝/μL，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.999;該方法的組內(nèi)變異系數(shù)為0.42％-1.9％，組間變異系數(shù)為0.68％-2.74％，表明具有良好的重復(fù)性;用此方法對(duì)HP-PRRSV、經(jīng)典PRRSV、PCV、PEDV、PRV、TGEV進(jìn)行檢測(cè)，均沒(méi)有交叉反應(yīng)，表明該方法的特異性好;并與常規(guī)RT-PCR

5、做對(duì)比，靈敏度是其的1000倍。
　　3.HP-PRRSV野毒及其疫苗毒株JXA1-R雙重?zé)晒釸T-PCR鑒別檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用
　　在建立單一熒光RT-PCR檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)條件的優(yōu)化，建立了鑒別檢測(cè)HP-PRRSV和JXA1-R的雙重?zé)晒釸T-PCR。該方法對(duì)HP-PRRSV和JXA1-R的檢測(cè)靈敏度分別為4.43拷貝/μL和4.12拷貝/μL，對(duì)HP-PRRSV檢測(cè)的批內(nèi)重復(fù)性變異系數(shù)CV％最大值為0.70％，

6、批間重復(fù)性變異系數(shù)CV％最大值為2.8％，對(duì)JXA1-R檢測(cè)的批內(nèi)重復(fù)性變異系數(shù)CV％最大值為0.62％，批間重復(fù)性變異系數(shù)CV％最大值為3.0％，均不超過(guò)5％，表明建立的方法重復(fù)性好;用此方法對(duì)經(jīng)典PRRSV、PCV、PEDV、PRV、TGEV等進(jìn)行檢測(cè)，均沒(méi)有交叉反應(yīng)，表明該方法的特異性好。用建立的方法對(duì)臨床200份血液樣品進(jìn)行了檢測(cè)，HP-PRRSV熒光RT-PCR方法檢測(cè)出32份陽(yáng)性，陽(yáng)性率為16％(32/200);JXA1-R