不結球白菜雄蕊突變系及其保持系中BcERF-B3基因功能的研究.pdf

1、不結球白菜（Brassica campestris ssp.chinensis Makino），原產中國大陸，是我國人民，尤其是南方群眾喜食的主要蔬菜之一。近些年來，其產量和質量需求不斷提高，但由于雄性不育品種較少且穩(wěn)定性較差，不能充分利用雜種優(yōu)勢來獲得優(yōu)良種質，故獲得優(yōu)質的雄性不育系成為如今十分迫切的任務之一。雄蕊花瓣化，可以徹底消除不育系自身花粉的影響，具有良好的科研利用價值。
　　本文在已獲得的不結球白菜中穩(wěn)定性較好的雄蕊瓣

2、化系及其保持系作為研究試驗材料，測定了2種材料中的一些代謝生理指標，用分子標記法獲得2種材料的差異片段并克隆出差異基因BcERF-B3的ORF全長，通過qRT-PCR的手段探究該基因在不同組織及器官中的表達，然后構建其過表達重組質粒，擬對該基因的功能進行轉基因驗證。另外，通過原核表達得到該基因的誘導蛋白，為下一步探究該基因作用的下游基因奠定基礎。本文主要研究結果如下:
　　1.形態(tài)觀察及生理指標的測定
　　本研究以實驗室保存

3、的不結球白菜雄蕊突變系和保持系為試驗材料，進行花器官形態(tài)觀測，并對花發(fā)育不同時期中2種材料SOD、POD及CAT活性、可溶性蛋白、可溶性糖和MDA含量進行測定。結果顯示，與保持系中相比，突變系花器官中最明顯的不同處在于其雄蕊完全缺失，而花瓣的數目則相應增加，雄蕊對應處的花瓣無花藥，推斷本研究中該雄蕊突變系可能屬于花同源異型的突變類型;與保持系花發(fā)育過程中三種抗氧化酶活性和MDA含量相比，突變系在中后期顯著升高;在花發(fā)育不同時期中，突變系

4、的可溶性糖和可溶性蛋白含量低于保持系，且2者在發(fā)育中期存在顯著差異。
　　2.BcERF-B3基因的分子克隆及乙烯調控分析
　　通過RT-PCR技術克隆出不同不結球白菜中差異基因，即乙烯響應因子（ERF）基因，命名為BcERF-B3，利用生物學軟件進行序列分析。結果顯示，不結球白菜BcERF-B3基因的0RF全長(807bp)，編碼268個氨基酸;RT-PCR分析發(fā)現，花期BcERF-B3基因在花瓣、雄蕊及花柱中表達量均顯著

5、高于保持系;實時熒光定量PCR(qPCR)發(fā)現，BcERF-B3基因在突變系花發(fā)育中期表達量明顯升高，且蕾期噴施乙烯(ET)能促進其表達，外施AgNO3抑制該基因表達。本研究表明BcERF-B3基因可能在花發(fā)育中期時響應內源ET而促進了雄蕊的發(fā)育異常。
　　3.BcERF-B3基因在不結球白菜響應脅迫中的表達及其過表達質粒的構建
　　為詳細了解BcERF-B3基因在不結球白菜突變系和保持系中不同脅迫下的表達譜，分別取樣進行q

6、PCR。結果發(fā)現，突變系中BcERF-B3基因響應ABA、MeJA和低溫脅迫，推測該基因可能受2種激素和低溫誘導，調控花器官的發(fā)育異常;利用Gateway技術手段，構成35S∷BcERF-B3的過表達重組質粒，并轉化入根癌農桿菌，為深入探索不結球白菜BcERF-B3基因的功能及作用機理，進一步優(yōu)化不結球白菜雄性不育品系奠定基礎。
　　4.不結球白菜BcERF-B3基因原核表達質粒的構建及原核表達
　　將BcERF-B3 OR

7、F全長片段定向插入原核表達載體pET30a中，并轉化至宿主菌BL21(DE3)進行蛋白誘導，對誘導的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)濃度、溫度條件進行優(yōu)化，以期獲得目的蛋白，為下一步的驗證奠定基礎。結果表明，pET30a-BcERF-B3成功導入宿主菌BL21(DE3)中;SDS-PAGE電泳結果顯示，重組質粒表達出35.4KD的融合蛋白，與編碼蛋白大小為29.6KD的預測結果一致，但條帶較弱;對誘導表達條件的優(yōu)化結果顯示，融合