高溫誘導對羅非魚性別分化相關基因表達的影響研究.pdf

1、動物性別決定模式是生物學領域的熱點研究問題，它對個體發(fā)育和自然種群性比組成等都具有深刻的影響。性別決定模式依據(jù)決定因素可分為基因型性別決定（Genotypic Sex Determination，GSD）和溫度依賴型性別決定(Temperature-dependentSex Determination, TSD)兩類。魚類的性別決定介于基因型性別決定(GSD)和溫度性別決定(TSD)之間，也稱為GSD+TE(Temperature Ef

2、fect)類型，即在性腺分化期溫度變化能部分影響魚類的性別決定。但溫度是如何影響魚類性別決定和分化的，至今仍是個謎。本研究以尼羅羅非魚幼魚為材料，利用qRT-PCR技術系統(tǒng)分析了高溫誘導對12個性別分化相關基因、4個熱休克蛋白及2個甲基轉移酶基因表達的影響。
　　 1.基因選擇和測序鑒定
　　 共挑選了18個在尼羅羅非魚性別分化過程中起作用的基因，其中性別分化相關基因12個，分別為:芳香化酶基因(Cyp19a1a和Cyp

3、19a1b)、Cyp11b2、Dmrt1、Fox12、Sox9a、ERα、ERβ、GTHα、FSHβ、LHβ和ARα;熱激蛋白基因4個，分別為:Hsp27、DNAJB1或Hsp40、Hsp70和Hsp90;甲基轉移酶基因2個，分別為Dnmt1和Dnmt3a。以EF-1α為持家基因。對其中7個基因(Hsp27、DNAJB1、Hsp70、Hsp90、Dnmt1、Dnmt3a和EF-1α)的預測序列進行克隆、測序，結果表明，得到的Hsp27、

4、DNAJB1、Hsp70、Hsp90、Dnmt1、Dnmt3a和EF-1α序列與預測序列同源性為99％，而且它們的部分氨基酸序列與斑馬魚的同源性在50％～90％之間。
　　 2.尼羅羅非魚遺傳性別鑒定
　　 由于Cyp19a1a和ERβ具有性別二態(tài)性表達的特點，利用qRT-PCR技術，分別以Cyp19a1a和ERβ為引物，性腺cDNA為模板來鑒定本實驗所用尼羅羅非魚幼魚的性別。結果顯示，Cyp19a1a擴增曲線明顯分為兩

5、簇，分別代表遺傳性雌魚和雄魚;ERβ的擴增曲線也得到了類似的結果。
　　 3.高溫誘導對尼羅羅非魚性別分化相關基因表達的影響
　　 高溫誘導后雌魚Cyp19a1a及Cyp19a1a轉錄調控因子—-Foxl2的相對表達水平均顯著下降(P＜0.05)。腦中控制卵巢發(fā)育的基因GTHα、 LHβ和ERα高溫誘導后表達水平也顯著下調(P＜0.05)，這顯示了高溫能抑制卵巢發(fā)育相關基因的表達。Spearman等級相關性分析結果顯示，

6、Cyp19a1a的表達量與GTHα和LHβ呈顯著性正相關(P＜0.05)。
　　 高溫誘導后，雌魚性腺中精巢發(fā)育相關基因Cyp11b2和Dmrt1的表達量都顯著上升(P＜0.05)。在腦中，ARα的表達量在高溫誘導后也顯著上升(P＜0.05)，這顯示了高溫誘導能提供強的雄性化信號。Spearman等級相關性分析結果顯示，Cyp11b2和ARα的表達量在雌魚性腺中與Cyp19a1a呈顯著性負相關(P＜0.05)。
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7、.高溫誘導對熱休克蛋白基因mRNA表達的影響
　　 qRT-PCR結果顯示，雌雄魚性腺中Hsp27、Hsp70和Hsp90 mRNA的表達水平在高溫誘導后都顯著上升(P＜0.05)，恢復后又降低到對照水平。在雌魚腦中，Hsp27、DNAJB1(Hsp40)和Hsp70的表達水平都顯著上升(P＜0.05)，而雄魚腦中Hsp27、DNAJB1和Hsp90的表達量在高溫誘導后都無明顯變化，Hsp70在雄魚腦中的相對表達水平從對照組、誘

8、導組到恢復組持續(xù)升高，且相互之間存在顯著差異(P＜0.05)。
　　 5.高溫誘導對甲基轉移酶基因mRNA表達的影響
　　 雌雄魚性腺中Dnmt1和Dnmt3a的表達水平在高溫誘導后均上升，并且存在兩性差異表達。高溫誘導后Dnmt1和Dnmt3a在雌性尼羅羅非魚腦中的變化趨勢與在性腺中一致，而在雄魚腦中的變化趨勢卻與在性腺中的相反。顯示了高溫誘導能提高羅非魚雌雄魚的甲基轉移酶表達水平，特別是Dnmt1的表達水平在雄魚性腺

9、中提高的幅度更大，高溫誘導可能通過影響羅非魚的甲基化水平，調控其他基因的表達，特別是性別分化相關基因的表達。
　　 總之，本文結果顯示高溫誘導能下調卵巢發(fā)育相關基因的表達，上調精巢發(fā)育相關基因的表達，初步證明了高溫誘導可能通過調控性腺分化相關基因的表達來影響性激素合成和誘導羅非魚性逆轉。羅非魚熱休克蛋白和甲基轉移酶基因高溫誘導后的表達變化顯示了它們在高溫誘導羅非魚性逆轉的過程中可能起著重要的作用。本文的結果為進一步研究溫度影響羅