化學-生物選擇性稀土元素標簽和蛋白摶元素質(zhì)譜絕對定量.pdf

1、作為蛋白質(zhì)組研究的重要組成部分,定量蛋白質(zhì)組學研究對于我們了解生命系統(tǒng)動態(tài)而又復雜的運行過程具有重要意義?；诜肿淤|(zhì)譜的蛋白質(zhì)定量技術雖然在蛋白質(zhì)組的相對定量中得到廣泛的應用,但是,隨著生命科學的發(fā)展,蛋白質(zhì)組的相對定量已經(jīng)難以滿足要求,發(fā)展蛋白質(zhì)的絕對定量技術已迫在眉睫。電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)由于具有高靈敏度、寬的動態(tài)范圍、同一元素的不同形態(tài)具有相同的信號響應等優(yōu)點,使它在蛋白質(zhì)絕對定量研究領域顯示出很大的潛力。已有的基

2、于ICP-MS的蛋白質(zhì)定量研究表明,通過蛋白質(zhì)分子中內(nèi)生的的S、P和Se以及各種金屬元素,或者通過人工標記的外源:Hg、Ⅰ和鑭系等元素,都可實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的絕對定量,其中稀土元素以其極高的靈敏度和眾多可選元素/同位素的等特點顯示出最大的潛力。由于基于ICP-MS的蛋白質(zhì)定量策略需要保證金屬標記蛋白質(zhì)的單一性,而目前的分離技術無法對整個蛋白質(zhì)組的所有蛋白質(zhì)進行完全分離。因此在本論文中,我們將以發(fā)展特異性的稀土標簽核心,降低對色譜/電泳分離的

3、依賴,使得利用ICP-MS對實際蛋白質(zhì)組樣品進行定量成為可能,具體的研究工作將在本博士論文中一一闡述。本論文主要包括以下六個部分的內(nèi)容:
　　 第一章主要對蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)組的相關背景知識進行了簡要介紹,回顧和概述了近幾年來基于分子質(zhì)譜和ICP-MS的蛋白質(zhì)定量分析技術、策略和發(fā)展趨勢。
　　 第二章以雙功能稀土螯合配體MMA-DOTA為橋梁,通過對標記條件的優(yōu)化,成功實現(xiàn)對胰島素(insulin),核糖核酸酶A(ribo

4、nuclease A)和溶菌酶(lysozyme)上的所有巰基的完全稀土標記,結合HPLC/SUID-ICP-MS技術實現(xiàn)對這3個蛋白質(zhì)的絕對定量,并證明對完整蛋白質(zhì)進行稀土標記與定量的可行性。
　　 第三章主要是以一種絲氨酸蛋白酶抑制劑4-2-胺乙基苯磺酰氟(4-(2-aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride,AEBSF)為基礎,通過點擊反應(clickchemistry)合成Eu標記的活性蛋白特

5、異性標簽(Europium-Labeled Activity-BasedProbe),成功地對多肽/蛋白質(zhì)混合物中兩種絲氨酸蛋白酶(serine proteases,SPs),即胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)和彈性蛋白酶(elastase)進行特異性、完全稀土標記,結合HPLC/SUID-ICP-MS技術實現(xiàn)對這2個模型SPs的絕對定量。進一步將這一技術應用于人體血漿,以及雄性大鼠組織中活性SPs的研究,結果表明這一技術不僅可

6、以評估蛋白酶抑制劑的水平,還能夠對生物組織中的差異表達SPs進行絕對定量。
　　 第四章結合光可裂解稀土標記酶活性標簽、點擊反應與納米技術,我們建立了一種集SPs的標記、純化、富集與定量于一體的多功能活性蛋白質(zhì)分析平臺(multifunctional active protein assay platform,MAPAP)。初步研究表明,MAPAP在生理條件下具有良好的穩(wěn)定性,在紫外光的照射下可以發(fā)生快速的光裂解。
　　

7、 第五章,利用蛋白酶專一性酶切多肽底物的原理,我們構建了稀土編碼多肽納米粒子(Lanthanide-coded Peptide-Specifc Nanoparticle,LnPeNP)探針用于蛋白質(zhì)的非標記檢測分析。由于ICP-MS可以分辨各種稀土元素,極大地降低光譜重疊的影響,因此可以根據(jù)目標蛋白酶對應的不同底物,設計合適的LnPeNP標簽用于多種目標蛋白酶的高靈敏度同時定量檢測。我們以trypsin和chymotrypsin為模型蛋