HCN2基因修飾的骨髓間充質干細胞源性起搏細胞的變時性相關受體的研究.pdf

1、背景：
　　心律失常是常見的心血管疾病，不僅影響人們的生活質量，而且是心臟性猝死最常見的原因。心臟電子起搏器植入是針對緩慢性心律失常、惡性室性心律失常的一種有效的干預措施和重要的治療方法，但從心臟的生理功能和人體適應性的角度看，心臟電子起搏器治療仍存在非生理性起搏等問題。用生物學方法重建具有自律性的生物活性細胞即“生物起搏器”是近年熱點研究課題。一些研究表明，用超極化激活的環(huán)核苷酸門控（HCN）基因家族修飾的干細胞可以產生超極化激

2、活的陽離子電流（If），其中HCN2和HCN4亞型在心臟竇房結細胞中的表達最為豐富。理想的生物起搏器不僅要有自律性，還應具有類似竇房結起搏細胞對交感神經和副交感神經調節(jié)作出反應的變時性能力。然而，關于用HCN2或HCN4基因修飾的干細胞是否具有變時性能力的研究甚少。腎上腺素能受體β1（Adrb1）和膽堿能受體M2（Chrm2）作為交感神經和副交感神經的受體，是心臟變時能力的分子基礎，細胞表達Adrb1和Chrm2是具備變時性能力的生物學

3、前提。
　　目的：
　　本研究探討在心肌細胞共培養(yǎng)微環(huán)境下HCN2基因修飾的骨髓間充質干細胞（BMSCs）表達變時性相關受體Adrb1和Chrm2的情況。
　　方法：
　　利用基因拼接技術和DNA重組技術，選用真核綠色熒光質粒載體pEGFP-C1和小鼠的起搏基因mHCN2在體外構建pEGFP-C1-mHCN2重組質粒，然后導入BMSCs，在特定環(huán)境下誘導定向分化為成熟的功能細胞。選取ICR乳鼠提取原代心肌細胞在3

4、7℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，選取4周雄性ICR小鼠提取BMSCs經流式細胞儀篩選鑒定后分為四組進行實驗，第一組為轉染pEGFP-C1-mHCN2質粒并與心肌細胞共培養(yǎng)48h的BMSCs（TF+CO組），第二組為單純轉染pEGFP-C1-mHCN2質粒培養(yǎng)48h的BMSCs（TF組），第三組為單純與心肌細胞共培養(yǎng)48h的BMSCs（CO組），第四組為培養(yǎng)48h未進行任何處理的BMSCs（CTL組）。經pEGFP-C1-mHCN2轉

5、染成功的細胞在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光。分別提取四組培養(yǎng)的BMSCs蛋白及RNA，通過蛋白質印跡法（Western blot）和實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）來檢測mHCN2通道的表達情況及Adrb1和Chrm2相關mRNA表達情況。心肌肌鈣蛋白I（cTnI）的表達可以通過膠體金免疫層析法（GICA）測定。
　　結果：
　?、僭跓晒怙@微鏡下觀察到TF和TF+CO組BMSCs的綠色熒光，表明兩組BMSCs轉染了m

6、HCN2基因，且重組質粒能在轉染的細胞中進行自我復制、轉錄和翻譯。
　?、诘鞍踪|印跡結果顯示HCN2通道蛋白在TF+CO和TF組中成功表達。
　?、跜O和TF+CO組檢測到cTnI的濃度，表明兩個實驗組的BMSCs可表達心肌細胞特異性標志物肌鈣蛋白I。
　?、躎F+CO和TF兩組Adrb1和Chrm2 mRNA的表達量均高于CTL和CO組（P＜0.05），并且，TF+CO組mHCN2和Chrm2 mRNA的表達顯著高于