HO-1在軟脂酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用研究.pdf

1、目的:阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以進(jìn)行性記憶和認(rèn)知功能減退為主要表現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，AD病人腦中中、長(zhǎng)鏈和極長(zhǎng)鏈脂肪酸水平增加，提示飽和脂肪酸可能在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。氧化應(yīng)激是AD的重要致病機(jī)制。軟脂酸(C16)等飽和脂肪酸可通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)的產(chǎn)生，誘發(fā)氧化應(yīng)激，在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因此，利用

2、抗氧化劑減少氧化應(yīng)激引起的腦損傷，有可能成為防治AD的重要靶點(diǎn)。
　　血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是腦內(nèi)的抗氧化酶之一，可通過(guò)其代謝產(chǎn)物（膽紅素等）清除活性氧，減輕氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞造成的損傷。HO-1基因上游有抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)。核轉(zhuǎn)錄因子NRF2(Nuclear factor erythroid-derived2-1ike2)是ARE

3、的激活因子。正常情況下，NRF2位于胞漿，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，NRF2在ERK等激酶作用下發(fā)生磷酸化，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)HO-1的轉(zhuǎn)錄。AD病人腦中HO-1表達(dá)有增加。提示，HO-1可能通過(guò)代償性表達(dá)增加，提高腦的抗氧化能力，來(lái)抵御AD的病理進(jìn)程。
　　本實(shí)驗(yàn)擬以軟脂酸C16作為刺激因素，以神經(jīng)母細(xì)胞瘤BE(2)-M17細(xì)胞為研究對(duì)象，在細(xì)胞水平研究在飽和脂肪酸誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)下，HO-1的上調(diào)機(jī)制及其抗氧化作用，為尋找

4、AD的防治靶點(diǎn)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　常規(guī)培養(yǎng)神經(jīng)母細(xì)胞瘤BE(2)-M17細(xì)胞。
　　2、ROS含量測(cè)定
　　DHE染色法或化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)細(xì)胞中ROS的含量。
　　3、實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)水平
　　Trizol法提取細(xì)胞總RNA。取2μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以18S rRNA做內(nèi)參，實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定HO-1和NRF2 mRNA的相對(duì)表達(dá)

5、量。
　　4、Western blot檢測(cè)目的基因蛋白表達(dá)水平
　　提取神經(jīng)細(xì)胞總蛋白，Western blot測(cè)定HO-1、NRF2和ERK蛋白的相對(duì)表達(dá)量以及p-ERK的蛋白水平。
　　5、細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)目的基因的定位或蛋白水平
　　對(duì)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，觀察細(xì)胞內(nèi)HO-1和NRF2的蛋白表達(dá)水平以及NRF2的入核情況。
　　6、數(shù)據(jù)處理
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理分析

6、。數(shù)據(jù)以(x)±SD表示，多組樣本之間兩兩比較用多個(gè)均數(shù)比較的方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、軟脂酸(C16)誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激。
　　給予細(xì)胞不同劑量的C16刺激2h，DHE染色法檢測(cè)細(xì)胞中的ROS水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，給予C16刺激后，細(xì)胞中的ROS呈劑量依賴性增加，并在200μM達(dá)到高峰。表明，軟脂酸誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激。
　　2、氧化應(yīng)激狀態(tài)下，神經(jīng)細(xì)胞中H

7、O-1的表達(dá)代償性增加。
　　給予細(xì)胞不同劑量的C16刺激2h，實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)HO-1mRNA的表達(dá)，Western blot和細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)HO-1的蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，給予C16刺激后，細(xì)胞中HO-1的mRNA和蛋白表達(dá)均呈劑量依賴性增加。表明，氧化應(yīng)激狀態(tài)下，HO-1的表達(dá)代償性增加。
　　3、HO-1的表達(dá)上調(diào)可減輕軟脂酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激。
　　1)氧化應(yīng)激狀態(tài)下，ERK激酶

8、被激活。
　　給予細(xì)胞不同劑量的C16刺激2h，Western blot檢測(cè)ERK激酶的表達(dá)及其磷酸化水平。結(jié)果顯示，給予C16刺激后，細(xì)胞中ERK的表達(dá)沒(méi)有明顯改變，但p-ERK的水平呈劑量依賴性增加。表明，氧化應(yīng)激狀態(tài)下，ERK激酶被激活。
　　為了進(jìn)一步明確ERK的活化與HO-1的表達(dá)之間的關(guān)系，將實(shí)驗(yàn)分為四組:對(duì)照組，C16組，ERK抑制劑組和ERK抑制劑+C16組。Westernblot檢測(cè)HO-1的表達(dá)和ERK的

9、表達(dá)及其磷酸化水平。發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，單獨(dú)給予C16后，HO-1的表達(dá)和p-ERK的水平明顯升高;而同時(shí)給予C16和ERK抑制劑后，與單獨(dú)給予C16相比，HO-1的表達(dá)和p-ERK的水平明顯降低。ERK的表達(dá)各組沒(méi)有明顯差異。表明，HO-1的表達(dá)上調(diào)可能與ERK相關(guān)信號(hào)途徑的活化有關(guān)。
　　2)氧化應(yīng)激狀態(tài)下，核轉(zhuǎn)錄因子NRF2被活化。
　　給予細(xì)胞不同劑量的C16刺激2h，細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)ERK的底物，HO-1的上游

10、調(diào)控因子NRF2的活性，即NRF2的入核情況。發(fā)現(xiàn)，給予C16刺激后，細(xì)胞核中NRF2的水平明顯增加。同時(shí)，用實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western blot檢測(cè)NRF2的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，給予C16刺激后，NRF2的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯增加。表明，HO-1的表達(dá)上調(diào)可能與ERK活化NRF2有關(guān)。
　　3) HO-1的表達(dá)上調(diào)可減輕軟脂酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。
　　實(shí)驗(yàn)分為四組:對(duì)照組，NRF2激動(dòng)劑組，C16組和N

11、RF2激動(dòng)劑+C16組。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，單獨(dú)給予C16或NRF2激動(dòng)劑后，HO-1的表達(dá)升高，而同時(shí)給予C16和NRF2激動(dòng)劑后，與單獨(dú)給予C16或NRF2激動(dòng)劑相比，HO-1的表達(dá)升高更為明顯?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果顯示，單獨(dú)給予C16刺激，與對(duì)照組相比，ROS的水平明顯增高;而同時(shí)給予C16和NRF2激動(dòng)劑后，與單獨(dú)給予C16相比，ROS的水平明顯降低。表明，上調(diào)HO-1的表達(dá)可以減輕軟