適度自噬通過(guò)抑制血管平滑肌細(xì)胞衰老對(duì)斑塊穩(wěn)定的作用機(jī)制及實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：目前，在全世界范圍內(nèi)由動(dòng)脈粥樣硬化（AS）引起的心肌梗死和心源性猝死等急性心血管事件已經(jīng)超越腫瘤成為危害人類(lèi)健康的頭號(hào)殺手。據(jù)2014年中國(guó)心血管病報(bào)告統(tǒng)計(jì)，我國(guó)心血管病現(xiàn)患人數(shù)為2.9億，意味著每10個(gè)成年人中有2個(gè)是心血管病患者，每年有超過(guò)250萬(wàn)人死于急性心肌梗死和心源性猝死，占中國(guó)農(nóng)村居民主要疾病死因構(gòu)成比的44.8％，并且經(jīng)成為嚴(yán)重威脅我國(guó)居民健康的最重要的疾病之一，其發(fā)病率及死亡率逐年攀升。臨床上有相當(dāng)一部分患者既

2、往無(wú)心血管疾病的相關(guān)癥狀，病情隱匿，突發(fā)的斑塊破裂導(dǎo)致嚴(yán)重的心血管事件，甚至威脅患者的生命。故易損斑塊（Vulnerable plaque）即包括不穩(wěn)定斑塊和有血栓形成傾向的斑塊越來(lái)越受到醫(yī)務(wù)工作者和科研人員的重視。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展、穩(wěn)定甚至消退不僅取決于斑塊的大小、斑塊的構(gòu)成成分及穩(wěn)定性是衡量斑塊是否穩(wěn)定的重要因素，如何有效增加易損斑塊的穩(wěn)定性，將是減少不良心血管事件的有益措施。
　　細(xì)胞自噬（autophagy）是在外界

3、壓力刺激（比如饑餓、炎癥、氧化應(yīng)激）下，細(xì)胞依賴(lài)溶酶體降解多余的或損傷的細(xì)胞內(nèi)有害成分而達(dá)到穩(wěn)定自身內(nèi)環(huán)境的目的，實(shí)際是對(duì)包括細(xì)胞器在內(nèi)的多種胞漿內(nèi)容物進(jìn)行充分的循環(huán)利用。自噬又稱(chēng)為Ⅱ型細(xì)胞死亡，它參與生物的生長(zhǎng)發(fā)育中的多種過(guò)程，廣泛存在于真核細(xì)胞中，是繼凋亡之后生命科學(xué)最熱的研究領(lǐng)域。已有的研究證實(shí)，AS斑塊中三種主要細(xì)胞即平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞均存在不同程度的自噬。自噬是影響斑塊穩(wěn)定性的重要因素之一，與AS的病理生理進(jìn)程密切

4、相關(guān)。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性取決于纖維帽的厚度和斑塊部位局部炎癥程度。斑塊破裂是由VSMCs死亡增加和分解膠原蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過(guò)度，隨后可能導(dǎo)致心肌梗塞或中風(fēng)。細(xì)胞增殖和遷移的平衡和細(xì)胞死亡和細(xì)胞衰老決定了VSMCs動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定，這些過(guò)程的調(diào)節(jié)對(duì)于動(dòng)脈粥樣化斑塊的形成和斑塊的穩(wěn)定性是至關(guān)重要的。
　　哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶的一部分，包mTORC1和mTORC2，其中mTOR

5、C1可調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路和生長(zhǎng)因子，密切參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、自噬等新陳代謝過(guò)程，mTOR也參與了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展和失穩(wěn)定，因此通過(guò)調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)通路可以干預(yù)自噬進(jìn)而影響斑塊進(jìn)展。大量文獻(xiàn)資料表明VSMCs的自噬參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，因而誘導(dǎo)VSMCs自噬可作為治療靶點(diǎn)來(lái)達(dá)到穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的目的。然而，斑塊中VSMCs自噬的相關(guān)機(jī)制尚未闡明。
　　正常血管壁VSMCs增殖指數(shù)很低，人類(lèi)進(jìn)展期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中

6、血管壁邊緣的VSMCs增殖減少，倍增時(shí)間延長(zhǎng)。這個(gè)對(duì)于體外培養(yǎng)的VSMCs結(jié)果提示S期百分比下降，G1期百分比增加。重要的是，這些細(xì)胞周期調(diào)控成為潛在的血管細(xì)胞衰老的標(biāo)志。既往的研究結(jié)果表明，在進(jìn)展期斑塊中VSMC增殖是增強(qiáng)而不是抑制，這可能是有益于斑塊的穩(wěn)定。同樣，如果VSMC增殖主要是修復(fù)動(dòng)脈粥樣化斑塊，增強(qiáng)VSMCs增殖的能力也可能是對(duì)穩(wěn)定斑塊是有益的。
　　有研究表明，mTOR/UKL1/ATG13信號(hào)通路可能是雷帕霉素促

7、進(jìn)VSMCs自噬的潛在的信號(hào)機(jī)制之一。然而，mTOR信號(hào)通路影響VSMCs代謝及動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展是復(fù)雜的。因此可以通過(guò)調(diào)節(jié)mTORC1/ULK1/ATG13信號(hào)通路上下游的關(guān)鍵分子實(shí)現(xiàn)對(duì)自噬的正向或負(fù)向調(diào)控。那么，是否可通過(guò)激活或抑制 mTORC1/ULK1/ATG13通路上下游關(guān)鍵分子和蛋白，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同階段AS斑塊內(nèi)細(xì)胞自噬的雙向調(diào)控呢？目前還沒(méi)有這方面的研究。
　　該研究旨在探討VSMCs自噬和衰老與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性的

8、關(guān)系，及是否可通過(guò)低等劑量的雷帕霉素誘導(dǎo)VSMCs適度自噬，調(diào)控細(xì)胞衰老和凋亡，抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展。
　　研究目的：
　　1.建立 ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型，分別使用自噬激動(dòng)劑和抑制劑干預(yù)并高脂喂養(yǎng)4周和16周后安樂(lè)死動(dòng)物，獲取小鼠的腹主動(dòng)脈組織，提前準(zhǔn)備4%多聚甲醛、錫箔紙等，制備不同用途的血管組織標(biāo)本。進(jìn)行血管標(biāo)本的HE染色、大體油紅及免疫組化染色，觀察斑塊大小、負(fù)荷及成分變化，比較各組斑塊穩(wěn)定性差異及

9、自噬標(biāo)志蛋白變化。
　　2.培養(yǎng)MOVAS細(xì)胞系，經(jīng)ox-LDL共孵育并使用自噬激動(dòng)劑和抑制劑干預(yù)后觀察各組細(xì)胞自噬水平及衰老程度的差異，明確雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬對(duì)VSMCs生存和衰老的影響。
　　3.細(xì)胞水平的上調(diào)和下調(diào)自噬后檢測(cè)mTORC1/ULK1/ ATG13信號(hào)通路相關(guān)蛋白及衰老相關(guān)標(biāo)志物的變化，明確雷帕霉素調(diào)節(jié)VSMCs自噬和衰老通過(guò)mTORC1/ULK1/ATG13信號(hào)通路起作用。
　　研究方法：
　

10、　1.選用雌性 ApoE-/-小鼠，6-8周齡，重量15-20g，并給予 apoE-/-小鼠高脂高膽固醇飲食(15%的脂肪和0.25%的膽固醇，購(gòu)自北京科奧協(xié)力飼料有限公司)喂養(yǎng)，構(gòu)建小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的動(dòng)物模型。分別在高脂喂養(yǎng)4周和16周后，安樂(lè)死動(dòng)物，取腹主動(dòng)脈的血管分別進(jìn)行HE染色（觀察斑塊局部形態(tài)）和大體油紅染色（整體分布），驗(yàn)證造模是否成功。
　　2. ApoE-/-小鼠被隨機(jī)分配，每組20只，分成五組：（1）對(duì)照組:小鼠

11、正常飲食4周、16周；（2）高脂組飲食(HFD)組:給與小鼠高脂飼料(含有15%的脂肪和15%膽固醇)喂養(yǎng)4周、16周；（3）低劑量雷帕霉素組:高脂飲食小鼠給與低劑量的雷帕霉素(50mg/Kg/d)喂養(yǎng)4周、16周；（4）高劑量雷帕霉素組:高脂飲食小鼠給與高劑量雷帕霉素(100 mg/Kg/d)喂養(yǎng)4周、16周；（5）3-MA組:高脂飲食小鼠給與自噬抑制劑3-MA(100 mg/Kg/d)喂養(yǎng)4周、16周。分別于4周、16周后，獲取小鼠

12、的腹主動(dòng)脈組織，分別進(jìn)行 HE染色、大體油紅染色及免疫組化染色（包括斑塊α-SMA免疫組化染色、斑塊CD68免疫組化染色、斑塊的天狼猩紅染色、斑塊組織的油紅染色），分別確定斑塊中各組分含量。
　　3.利用Image J分析軟件分別計(jì)算脂質(zhì)核、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和膠原纖維占血管壁的比例。斑塊易損性的組織學(xué)計(jì)算公式為：(脂質(zhì)含量+巨噬細(xì)胞含量)/(平滑肌細(xì)胞含量+膠原纖維含量)×100%。
　　4.利用透射電鏡觀察腹主動(dòng)脈斑塊

13、組織中自噬小體的形成及Western blot法檢測(cè)斑塊中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，證實(shí)各組小鼠自噬水平的差異。
　　5.選用 MOVAS(小鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞系)，培養(yǎng)并傳代3次后倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)良好并進(jìn)行分組：（1）對(duì)照組：細(xì)胞與DMEM孵化；（2）ox-LDL組：使用ox-LDL(50mg/ml)共同培養(yǎng)72小時(shí)；（3）ox-LDL+低濃度的雷帕霉素組：ox-LDL預(yù)處理后的細(xì)胞與雷帕霉素(10ng/ml)再培養(yǎng)24

14、小時(shí)；（4）ox-LDL+高劑量雷帕霉素組：ox-LDL預(yù)處理后的細(xì)胞與雷帕霉素(30ng/ml)再培養(yǎng)24小時(shí)；（5）ox-LDL+3-MA組：ox-LDL預(yù)處理后的細(xì)胞與3-MA(25mg/ml)共培養(yǎng)24小時(shí)。利用透射電鏡觀察各組細(xì)胞中自噬小體的形成，細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞LC3表達(dá)情況。
　　6.采用凱基細(xì)胞衰老檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組MOVAS細(xì)胞衰老情況，并計(jì)算(SA-β-Gal)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)比值。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)

15、細(xì)胞周期，測(cè)定各組細(xì)胞在不同細(xì)胞周期的百分比。
　　7.各組細(xì)胞干預(yù)完成后提取細(xì)胞蛋白并用免疫印跡分析方法分析 mTORC、ULK1、p-ULK1、LC3Ⅰ/Ⅱ、ATG13、p53、p21及p16的蛋白表達(dá)水平，明確雷帕霉素調(diào)節(jié)VSMCs自噬和衰老通過(guò)mTORC1/ULK1/ATG13信號(hào)通路起作用。
　　研究結(jié)果：
　　1.主動(dòng)脈HE染色提示apoE-/-小鼠喂養(yǎng)4周后各組間斑塊大小差異不顯著。然而， apoE-/-

16、小鼠喂養(yǎng)16周后與HFD相比，自噬激動(dòng)劑雷帕霉素組可以顯著減少斑塊面積,自噬抑制劑3-MA則有相反的趨勢(shì)。此外，油紅染色整個(gè)動(dòng)脈的斑塊面積證明相比 HFD組，雷帕霉素組可顯著降低動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的面積及斑塊負(fù)荷，3-MA組作用與之相反(斑塊面積占整個(gè)血管面積的比例分別為3-MA組77.3%±0.02%與低劑量雷帕霉素組59.3%±0.01%)。
　　2.免疫組織化學(xué)染色分析 apoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中各組分含量表明，低劑

17、量雷帕霉素治療后與HFD組相比明顯下降CD68占整個(gè)斑塊的百分比，而3-MA與雷帕霉素作用相反。同樣，低劑量雷帕霉素也顯著減少壞死核心區(qū)域。然而，低劑量雷帕霉素治療組比其他組相比α-SMA和膠原蛋白的在斑塊的分布比例明顯增加。進(jìn)一步分析斑塊穩(wěn)定性顯示低劑量雷帕霉素顯著增加斑塊的穩(wěn)定性，而HFD和3-MA組則相反。
　　3.透射電鏡觀察雷帕霉素組自噬小體數(shù)量與3-MA組相比明顯增多，自噬小體為髓鞘樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞質(zhì)中泛素化包涵體聚集及空

18、泡形成增多。取小鼠主動(dòng)脈組織用Western blot檢測(cè)各組斑塊中LC3、P62表達(dá)水平，低劑量雷帕霉素組中LC3II/I比值與3-MA組相比增多，P62降解增多，自噬增強(qiáng)。
　　4. MOVAS傳代培養(yǎng)3代后，細(xì)胞為長(zhǎng)梭型，形態(tài)飽滿，胞體透亮，均勻分布于瓶底。經(jīng)ox-LDL干預(yù)后鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)多樣，變圓呈球形或多角形，胞體腫脹，細(xì)胞間隙增寬，連接稀少，并且可見(jiàn)較多細(xì)胞脫落、漂浮于培養(yǎng)液中。
　　5.透射電子顯微鏡(TE

19、M)和免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，ox-LDL干預(yù)72小時(shí)后， VSMCs接受低劑量雷帕霉素后表現(xiàn)出的典型自噬增強(qiáng)的特征即增加LC3 II表達(dá)增加和自噬小體的形成增多。然而，3-MA組對(duì) VSMCs自噬的抑制作用與雷帕霉素組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6.在 ox-LDL干預(yù)72小時(shí)后，VSMCs形態(tài)變成為擴(kuò)大和扁平的形態(tài)與強(qiáng)陽(yáng)性染色β-半乳糖苷酶染色(SA-β-Gal)。低劑量雷帕霉素治療可以顯著減少 VSMCs中衰老相關(guān)的β-半乳糖的

20、表達(dá)。然而，3-MA逆轉(zhuǎn)雷帕霉素的影響。流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)顯示低劑量雷帕霉素促進(jìn)VSMCs促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，而ox-LDL和3-MA組無(wú)此作用。我們進(jìn)一步研究了衰老標(biāo)記蛋白p16和p21的表達(dá)水平。免疫印跡結(jié)果顯示，ox-LDL干預(yù)后p16和p21的表達(dá)明顯升高。低劑量雷帕霉素治療可顯著降低VSMCs衰老標(biāo)記物的表達(dá)，而3-MA與雷帕霉素的作用相悖。
　　7.進(jìn)一步研究 VSMCs自噬和衰老的可能機(jī)制，評(píng)估了自噬相關(guān)蛋白 mTORC1

21、、ATG13的水平。免疫印跡結(jié)果表明低劑量雷帕霉素顯著mTORC1的表達(dá)減少，但增加了VSMCs中 ULK1和ATG13的蛋白質(zhì)含量，相比之下，ox-LDL誘導(dǎo)組含量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與此同時(shí)，雷帕霉素降低ULK1的磷酸化水平。此外，低劑量雷帕霉素能抑制由降低VSMCs中p53蛋白表達(dá)。然而,3-MA組與雷帕霉素組對(duì)這些蛋白表達(dá)的影響作用相反。
　　研究結(jié)論:
　　1.低劑量的自噬激動(dòng)劑雷帕霉素可以抑制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展，促