UBE2C基因在斑馬魚胚胎發(fā)育中的時空表達規(guī)律.pdf

1、目的:通過前期對不同時間點小鼠胎肝及成年肝的lncRNA和mRNA進行表達譜芯片檢測，發(fā)現多個編碼基因和非編碼基因位于共表達網絡的核心區(qū)域，其中共表達關系指數最高的分子是UBE2C分子，泛素偶聯(lián)酶E2家族中的一員。芯片結果顯示其在小鼠14.5天胎肝中表達最高，熒光值達31643，而成年小鼠肝臟的表達值只有152，相差200倍。UBE2C在胎肝中的高表達是否提示它在胚胎發(fā)育過程中起到重要的調控作用？與哪些組織器官的發(fā)育相關？這些問題引起了

2、我們極大的興趣。
　　在真核細胞中，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-proteasomesystem，UPS)通過介導細胞質、細胞核中靶蛋白的泛素化修飾、降解，參與調控細胞周期、細胞凋亡、基因轉錄、染色質穩(wěn)定性、DNA損傷修復以及抗原提呈等生命過程。泛素分子在泛素激活酶(Ubiquitin-activatingenzyme，E1)、泛素偶聯(lián)酶（Ubiquitin-conj ugating enzyme，E2）、泛素連接酶(

3、Ubiquitin ligase，E3)順序催化作用下與底物蛋白共價結合，使靶蛋白最終被26S蛋白酶體識別并降解。UBE2C(ubiquitin-conjugating enzymes2C)，是參與細胞有絲分裂調控的泛素偶聯(lián)酶E2家族成員之一，該酶是細胞周期蛋白(cyclins)降解和細胞周期進程調控所必需的。UBE2C與有絲分裂后期促進復合物(anaphase-promoting complex/ cyclosome，APC/C)相互

4、識別，把活化的泛素轉移到底物蛋白上，使底物蛋白多泛素化，進而被蛋白酶體識別并降解。在細胞有絲分裂中期，UBE2C通過APC/C CDC20介導的securin、cyclin B的降解，促進細胞進入有絲分裂后期。在M后期到來之前染色體蛋白復合物cohesin將姐妹染色體緊密結合在一起，而separase通過裂解cohesin的半胱氨酸，導致姐妹染色體分離，但同時separase的活性又被securin所抑制。因此，由UBE2C-APC/C

5、 CDC20介導的securin的降解和separase的激活是啟動細胞進入有絲分裂后期所必須的。而UBE2C-APC/C CDC20介導的cyclin B的降解則是M期終止的首要步驟。在M后期，細胞周期蛋白依賴性激酶-1(cyclin dependentkinases，CDKs)與cyclin B形成復合物，此時Cdk1具有活性;而隨著cyclin B的降解，Cdk1的活性降低，進而造成Cdh1的去磷酸化，Cdh1取代CDC20與AP

6、C結合，形成APC/C Cdh1，接管M期結束后調控因子的泛素化。
　　近年來UBE2C成為腫瘤研究的熱點。在體內、體外實驗中，過表達UBE2C促進細胞增殖、不依賴支持物生長。在大多數正常組織中，UBE2C表達量很低以至于難以被檢測到，然而在鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、前列腺癌等多種癌組織中發(fā)現，其表達異常增高，并且與預后存在一定相關性。研究發(fā)現，UBE2C轉基因小鼠會出現cyclin B過早降解、額外的中心粒、染色體滯后及非整倍

7、體現象，進而形成廣泛性的自發(fā)性腫瘤。然而UBE2C在腫瘤組織中表達上調的機制卻不十分清楚。隨著發(fā)育分子生物學、分子生物學、腫瘤免疫學的發(fā)展，越來越多的證據表明，早期胚胎各組織器官的發(fā)育與腫瘤發(fā)生過程在基因、蛋白、信號通路上有明顯的重疊，因此對胚胎發(fā)育過程的研究對了解相關腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制具有重要指導作用。然而，UBE2C是否參與了胚胎發(fā)育的調控，及如何調控各組織的胚胎發(fā)育，關于這些的相關報道卻十分少見。因此，我們決定利用斑馬魚這種模式生

8、物，借助Real-Time PCR、整胚原位雜交技術對ube2c在胚胎不同時間點的表達進行檢測，以便今后對其功能作用進行進一步的研究，并為相關腫瘤的研究提供新的思路。
　　方法:選擇受精后0小時(hour post fertilization，hpf)、2hpf、4 hpf、8 hpf、12 hpf、24 hpf、48 hpf、72 hpf及7dpf(day post fertilization,dpf)的斑馬魚魚卵，提取RNA、

9、反轉錄后進行Real-Time PCR對ube2c在不同時間段的表達進行檢測;通過合成的地高辛標記反義ube2c RNA探針，對以上各時間段胚胎進行整胚原位雜交，觀察ube2e在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的時空表達規(guī)律。
　　結果:Real-Time PCR結果顯示，發(fā)現ube2c在0hpf（1-cell）即有表達，4hpf（囊胚期）其表達最高，在孵化期(48hpf)之后則降低到較低水平。整胚原位雜交顯示，0hpf即可檢測到ube2c的

10、表達信號，并集中在胚盤處;從卵裂期(0.75-2.25hpf)直到12 hpf，ube2c均呈廣泛性分布;24 hpf開始，表達信號呈現一定組織特異性，在48 hpf之后，信號主要集中耳囊、肝、生殖系等處。
　　結論:斑馬魚ube2c的表達具有明顯的母源表達特征，推測其可能通過參與母源蛋白的泛素化降解來調控胚胎的發(fā)育，其在耳囊、肝、生殖系等組織器官的特異性表達也為UBE2C在胚胎發(fā)育中的功能研究提供了研究方向，同時也為其在腫瘤中的