芽孢桿菌促生抑菌物質(zhì)鑒定及機(jī)理研究.pdf

1、根際促生細(xì)菌（PGPR）是指生存在根際范圍內(nèi)，對(duì)植物生長(zhǎng)有促進(jìn)或?qū)Σ≡修卓棺饔玫挠幸婕?xì)菌的統(tǒng)稱。目前已報(bào)道的促生機(jī)制包括提高氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素的可利用性，分泌生長(zhǎng)素、分裂素、赤霉素等植物激素，產(chǎn)生ACC脫氨酶降低植物體內(nèi)乙烯含量，產(chǎn)生2，3-丁二醇、3-羥基-2-丁酮等揮發(fā)性物質(zhì)等。芽孢桿菌是一類(lèi)重要的根際促生細(xì)菌，由于其能產(chǎn)生抗逆性強(qiáng)的芽孢、對(duì)環(huán)境和人畜安全等特性而被廣泛地應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌OKB10

2、5能夠促進(jìn)煙草和水稻等植物生長(zhǎng)、提高煙草對(duì)花葉病毒的抗性，還可以用于防治根結(jié)線蟲(chóng)病，但是其促生和生防機(jī)制尚不完全清楚。本研究通過(guò)與水稻互作的枯草芽孢桿菌OKB105表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析，結(jié)合其突變體文庫(kù)篩選，確定芽孢桿菌促生相關(guān)基因，再對(duì)這些基因進(jìn)行定點(diǎn)突變和功能回復(fù)，結(jié)合構(gòu)建突變體、高效液相色譜、Real-time PCR、Elisa等技術(shù)確定該促生物質(zhì)和其促生機(jī)理。此外，本研究還評(píng)估了芽孢桿菌揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)水稻白葉枯病菌（Xanthomon

3、as oryzae pv.oryzae）的抑菌效果，鑒定出具有抑菌活性的揮發(fā)性物質(zhì)，并研究其抑菌機(jī)理。主要研究結(jié)果如下:
　　1.枯草芽孢桿菌OKB105能夠明顯促進(jìn)水稻株高的生長(zhǎng)，促生效果為25.2％。為了揭示其促生機(jī)制，對(duì)與水稻互作2h的枯草芽孢桿菌OKB105的表達(dá)譜進(jìn)行分析。結(jié)果表明，與水稻互作后共有176個(gè)基因的表達(dá)水平發(fā)生差異變化，占枯草芽孢桿菌OKB105轉(zhuǎn)錄組的3.8％。針對(duì)其功能已知的122個(gè)差異表達(dá)的基因進(jìn)行功

4、能分析，主要涉及新陳代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)、運(yùn)動(dòng)性、趨化性等方面，其中4組基因受水稻影響最大，分別是:與碳水化合物、氨基酸代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因;與轉(zhuǎn)錄調(diào)控子相關(guān)的基因;與產(chǎn)孢、運(yùn)動(dòng)性、趨化性相關(guān)的基因以及與糖醛酸磷壁酸生物合成相關(guān)基因。這些結(jié)果表明在芽孢桿菌與植物互作的過(guò)程中:(1)芽孢桿菌能夠利用植物分泌的物質(zhì)作為碳源和氮源;(2)芽孢桿菌能夠感受周?chē)h(huán)境的變化作出反應(yīng)，提高自身的競(jìng)爭(zhēng)力;(3)植物能夠通過(guò)向芽孢桿菌提供能量來(lái)間接的影響其產(chǎn)孢及細(xì)

5、胞壁成分等。通過(guò)表達(dá)譜芯片技術(shù)分析了與水稻互作后的OKB105差異表達(dá)基因，為進(jìn)一步揭示植物與芽孢桿菌的互作機(jī)制打下基礎(chǔ)。
　　2.同時(shí)對(duì)枯草芽孢桿菌OKB105促生活性物質(zhì)的基本特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)這種促生物質(zhì)熱穩(wěn)定，且分子量＜3kDa。隨后對(duì)構(gòu)建的OKB105突變體文庫(kù)中的700個(gè)突變體進(jìn)行篩選，篩選出4個(gè)同時(shí)對(duì)煙草和水稻促生缺陷的突變體。隨后通過(guò)反向 PCR等技術(shù)對(duì)4個(gè)突變體中轉(zhuǎn)座子的插入位點(diǎn)進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)4個(gè)被突變基因分別為

6、:yecA基因編碼假定的氨基酸/多胺透性酶;yusV基因編碼Fe(Ⅲ)-嗜鐵素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與Fe(Ⅲ)攝取相關(guān);sigH基因編碼RNA聚合酶sigma H因子;comX基因編碼信息素前體，與感受態(tài)形成相關(guān)。結(jié)合表達(dá)譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)表達(dá)譜數(shù)據(jù)中差異表達(dá)的speA基因和本章篩選出的yecA基因都與多胺相關(guān)。speA基因編碼精氨酸脫羧酶，參與多胺的生物合成，ecA則與多胺轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。因此，推測(cè)枯草芽孢桿菌OKB105對(duì)植物的促生活性與多胺有關(guān)。

7、>　　3.為了證實(shí)這一猜測(cè)，構(gòu)建了yecA和speB的定點(diǎn)突變體，編碼假定的氨基酸/多胺透性酶的yecA基因和編碼胍丁胺酶的speB基因分別參與枯草芽孢桿菌OKB105的多胺分泌和生物合成過(guò)程，這兩個(gè)基因的破壞都會(huì)導(dǎo)致OKB105促生能力的缺陷，而speB的功能回復(fù)體則會(huì)恢復(fù)其對(duì)植物的促生效果。隨后結(jié)合衍生及HPLC技術(shù)對(duì)OKB105及其突變體的發(fā)酵上清液進(jìn)行分析，確定亞精胺是OKB105促進(jìn)植物生長(zhǎng)的關(guān)鍵物質(zhì)。同時(shí)用不同濃度人工合成的

8、亞精胺浸種處理煙草，發(fā)現(xiàn)5-100μM的亞精胺確實(shí)能夠促進(jìn)煙草根的生長(zhǎng)。通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)煙草體內(nèi)促生相關(guān)基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)OKB105、speB功能回復(fù)體和5μM亞精胺處理過(guò)的煙草的擴(kuò)張蛋白基因Nt-EXPA1和Nt-EXPA2上調(diào)表達(dá)，乙烯合成相關(guān)基因ACO1下調(diào)表達(dá)，而ELISA結(jié)果同樣證明OKB105、speB功能回復(fù)體和亞精胺處理能夠明顯降低煙草葉片的乙烯含量。這些結(jié)果表明OKB105分泌的亞精胺在一定程度上

9、通過(guò)誘導(dǎo)擴(kuò)張蛋白相關(guān)基因的表達(dá)和抑制乙烯的合成來(lái)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。首次證實(shí)了芽孢桿菌通過(guò)分泌亞精胺促進(jìn)植物生長(zhǎng)，揭示了芽孢桿菌促生的一種新機(jī)制。
　　4.本論文還對(duì)芽孢桿菌揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌活性進(jìn)行了評(píng)估。首先對(duì)50株芽孢桿菌揮發(fā)性物質(zhì)的抑細(xì)菌活性進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌OKB105和蠟樣芽孢桿菌D13產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)能夠明顯抑制水稻白葉枯病菌（Xoo）的菌落生長(zhǎng)和細(xì)胞活性。通過(guò)掃描電鏡和透射電鏡技術(shù)對(duì)Xoo的外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行

10、分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)照Xoo細(xì)胞壁光滑，細(xì)胞呈桿狀，而揮發(fā)性物質(zhì)處理后的Xoo細(xì)胞壁凹陷，細(xì)胞變得畸形、膨脹或是皺縮，不呈桿狀，且細(xì)胞質(zhì)濃縮。此外，D13揮發(fā)性物質(zhì)處理能夠降低Xoo的致病力和抑制致病相關(guān)基因的表達(dá)。隨后，通過(guò)氣質(zhì)聯(lián)用對(duì)OKB105和D13產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析，鑒定出OKB105產(chǎn)生的7個(gè)揮發(fā)性物質(zhì)和D13產(chǎn)生的12個(gè)揮發(fā)性物質(zhì)。其中，癸醇和3，5，5-三甲基己醇能夠抑制Xoo的生長(zhǎng)，并且3，5，5-三甲基己醇對(duì)水稻細(xì)菌性條