SaeRS,Agr和SarA對金黃色葡萄主要粘附蛋白的調控.pdf

1、目的：
　　金黃色葡萄球菌是一種常見病原菌，可引起多種感染。在我國流行的金黃色葡萄球菌主要是ST239型和ST5型。金黃色葡萄球菌的傳播，流行及其所致感染類型與之分泌的多種粘附蛋白密切相關，這些粘附蛋白的表達受到多種調控系統(tǒng)的控制。有研究報道，新發(fā)現(xiàn)的粘附相關蛋白sasX可以促進ST239型和ST5型金黃色葡萄球菌在醫(yī)院的傳播。粘附蛋白的流行病學和功能研究很多，但是調控機制還不完全清楚，尤其是新發(fā)現(xiàn)的sasX蛋白，其調控機制還未見

2、報道。有研究報道葡萄球菌附屬基因調節(jié)子agr、葡萄球菌輔助調節(jié)因子sarA和雙組分信號轉導系統(tǒng)saeR主要調節(jié)各種分泌蛋白的表達，包括粘附和毒力蛋白。我們通過基因敲除方法構建了sarA、agrA、saeRS基因敲除突變株，對saeRS、agr和sarA對金黃色葡萄球菌主要粘附基因的調控機制進行了初步探討。
　　方法：
　　首先利用PCR擴增金黃色葡萄球菌HS770的saeRS、sarA、agrA基因的上下游同源臂;用溫度敏感

3、型質粒pKOR1，分別構建沒有目的DNA的重組質粒，經過大腸埃希菌DC10B的修飾，電轉進入目的細菌HS770;經過不斷的變溫傳代，使質粒上的同源臂與基因組上的目的DNA發(fā)生同源重組，再用脫水四環(huán)素誘導ccdB基因和反義secY RNA表達，篩選saeRS、sarA、agrA的疑似突變株;經過PCR、RT-PCR和測序鑒定得到HS770△agrA、HS770△saeRS以及HS770△sarA敲除突變株;用RT-PCR和Western-

4、blot檢測saeRS、sarA、agrA對sasX基因的轉錄及表達水平的影響;利用RT-PCR檢測saeRS、sarA、agrA對spa，fnbpB，sasX轉錄水平的影響;同時分別檢測野生株HS770以及HS770△saeRS、HS770△sarA、HS770△agrA敲除突變株的起始粘附能力和生物膜形成能力變化。
　　結果：
　　金黃色葡萄球菌臨床分離株HS770。PCR檢測saeRS、sarA、agrA、sasX陽性

5、。將saeRS、sarA、agrA基因上下游DNA片段進行連接，所得連接產物與質粒pKOR1進行B-P反應得到pKOR1-△saeRS、pKOR1-△sarA、pKOR1△-agrA重組質粒，將重組質粒電轉進HS770，發(fā)生同源重組，得到HS770△saeRS、HS770△sarA、HS770△agrA突變敲除株。用PCR、RT-PCR、測序的方法驗證敲除成功。首先我們檢測了野生株和各個基因敲除株的生長曲線，結果顯示各菌的生長曲線基本相

6、似，在穩(wěn)定期后期agr突變株相對其他幾株菌生長有所增快。抽取3h、6h、9h、12h野生株和各個基因敲除株的RNA， qRT-PCR檢測sasX、spa、fnbpB的轉錄水平，與野生株對比，△sarA突變株中sasX基因在3h、6h、9h、12h均上調4倍4倍32倍32倍，spa，fnbpB6h、9h、12h轉錄下調;△agrA突變株中sasX基因在3h、6h、9h、12h分別升高32倍100多倍8倍以及2倍，spa，fnbpB6h、9

7、h、12h轉錄明顯上調;△saeRS突變株中三個基因變化不大。提取3h、6h、9h、12h野生株和三個基因敲除株的菌體蛋白用抗sasX多克隆抗體進行Western-blod，與野生株相比△sarA突變株中3h、6h、9h、12h表達量都增高，△agrA突變株中6h表達量減少，9h、12h表達量有所增加，△sae RS突變株中基本無變化。qRT-PCR與Western-blot結果提示saeRS對sasX、 spa、fnbpB可能沒有調控

8、，agrA對sasX、 spa、fnbpB存在負調控作用，sarA對sasX存在負調控作用，對spa、fnbpB正調控作用。檢測了野生株和三個基因敲除株的起始粘附能力和生物膜形成能力:起始粘附能力基本沒有變化;sarA突變敲除株生物膜形成能力下降很多，saeRS和agrA突變株生物膜形成能力基本沒有變化。
　　結論：
　　1.基因敲除方法敲除臨床分離株HS770的saeRS、agrA、sarA基因，得到HS770△saeRS