NS3蛋白對乙型腦炎病毒增殖的影響及其宿主互作蛋白的篩選.pdf

1、流行性乙型腦炎是由乙型腦炎病毒(JEV)引起的一種主要經(jīng)蚊蟲傳播的人畜共患傳染病，對人類健康與養(yǎng)豬業(yè)產(chǎn)生極大危害。JEV感染宿主細胞具有一個完整的復制周期，包括吸附、穿入、脫殼、合成、組裝與釋放。JEV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3是一個具有多種酶活性的蛋白，其在JEV感染與復制過程中發(fā)揮重要作用。乙腦病毒作為一個結(jié)構(gòu)較為簡單的病毒，宿主與病毒蛋白之間的相互作用被認為是乙腦病毒致病的重要機制。本研究運用RNAi技術(shù)研究JEV NS3基因的沉默對體內(nèi)和

2、體外JEV增殖的影響，并利用酵母雙雜交和免疫共沉淀技術(shù)篩選能與NS3蛋白互作的宿主細胞蛋白，旨在深入地了解NS3蛋白對JEV增殖的影響及其具體作用機制。本研究不僅為闡明乙腦病毒增殖機理提供重要理論依據(jù)，還為抗病毒藥物靶點的研究開辟新的方向。
　　1、NS3蛋白對乙型腦炎病毒增殖影響的研究
　　設計了4個乙型腦炎病毒NS3基因的RNAi靶位點，分別位于JEV基因組4656-4676、4827-4847、4916-4936與53

3、61-5381位，將其插入表達載體pGPU6/GFP/Neo中，構(gòu)建了能夠?qū)hRNA導入細胞的重組表達質(zhì)粒pGP-shRNA，并證明了shRNA質(zhì)粒能夠特異性抑制NS3基因的表達。將shRNA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BHK21細胞后，間隔24h感染JEV。JEV感染細胞72h后，收集病毒培養(yǎng)物，運用熒光定量PCR，空斑減少實驗，間接免疫熒光與Western blot檢測JEV增殖量的變化。結(jié)果顯示4個shRNA表達質(zhì)粒對JEV的增殖均有不同程度的

4、抑制作用。其中pGP-NS3-4質(zhì)粒（基因組5361-5381）抑制效果最為顯著，其使細胞中JEV mRNA的含量降低93.9％;病毒滴度下降大約950倍;間接免疫熒光結(jié)果顯示細胞中乙腦病毒數(shù)量明顯減少，Western blot結(jié)果顯示乙腦病毒結(jié)構(gòu)蛋白E蛋白含量顯著降低。
　　將7日齡乳鼠分為7組，每組6只，4個pGP-shRNA質(zhì)粒分別每只腦內(nèi)接種2μg，接種24h后以10×LD50的劑量進行腦內(nèi)攻毒，攻毒5d后，取鼠腦制成10

5、％組織懸液，應用空斑減少實驗測定病毒滴度。結(jié)果顯示4個shRNA質(zhì)粒均使乳鼠腦組織中JEV的病毒滴度顯著降低，其中pGP-NS3-4質(zhì)粒（基因組5361-5381）效果最佳，使毒價下降大約2400倍。又將pGP-NS3-4質(zhì)粒接種3周齡小鼠，間隔24h以不同劑量攻毒，結(jié)果顯示pGP-NS3-4質(zhì)粒能為3周齡小鼠提供一定保護，10×LD50攻毒組保護率高達70％，50×LD50攻毒組保護率為60％。
　　本研究證明了NS3蛋白對JE

6、V的增殖具有重要作用，同時發(fā)現(xiàn)了JEV基因組5361-5381位是一個高效的NS3基因沉默靶位點，針對該位點的基因沉默對JEV在體內(nèi)外增殖具有顯著的抑制作用。該研究為乙腦病毒NS3蛋白功能以及其作為抗乙腦病毒靶點的深入研究提供了重要支持。
　　2、乙型腦炎病毒NS3蛋白宿主細胞互作蛋白篩選
　　以JEV野毒分離株SCYA201201為模板，擴增全長NS3基因，并將其插入pGBKT7載體構(gòu)建了pGBKT7-NS3誘餌質(zhì)粒。隨后

7、將誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入酵母菌Y2HGold，獲得了誘餌酵母菌，并對誘餌酵母菌進行了包括毒性、自激活驗證和蛋白表達鑒定，結(jié)果顯示NS3片段的插入對誘餌酵母菌沒有毒性作用，NS3基因沒有自激活作用并且誘餌酵母菌能成功表達全長NS3蛋白。
　　采用Gold Yeast Two-Hybrid System系統(tǒng)將構(gòu)建的誘餌酵母菌與人腦組織cDNA文庫酵母菌進行酵母雙雜交，連續(xù)在DDO/X/A和QDO/X/A營養(yǎng)缺失平板上篩選，經(jīng)過三輪的篩選，最終

8、獲得了21個陽性克隆子。陽性克隆子經(jīng)過擴大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，利用文庫質(zhì)粒的抗性篩選出單克隆，提取質(zhì)粒并進行測序分析，結(jié)果顯示除了8個重復序列、4個非編碼區(qū)序列和1個移碼突變序列外，最終獲得了8個NS3宿主互作蛋白的編碼基因序列，將這些序列在NCBI上進行Blast分析，結(jié)果顯示它們與Genbank中的參考序列相似性均高達99％以上。隨后將這8個文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母菌Y187株，構(gòu)建獵物酵母菌，并將之與NS3誘

9、餌酵母菌進行回復雜交驗證，同時設立文庫菌自激活對照組，結(jié)果顯示8個雜交菌落均呈現(xiàn)陽性，自激活對照組全為陰性，回復驗證成功。
　　本研究成功從人腦組織cDNA文庫中篩選獲得8個新的宿主互作蛋白，其分別是:腓骨蛋白FBLN5、蛋白磷酸脂酶PPP2CB、CRBN蛋白、G蛋白偶聯(lián)受體GPR137B、泛素結(jié)合酶UBE2N、鋅指蛋白ZNF350、熱激蛋白Hsp40和信號復合體蛋白COP9。這些互作蛋白的成功篩選為深入研究NS3蛋白互作網(wǎng)絡及N

10、S3蛋白參與JEV增殖的機制奠定了重要基礎。
　　3、乙型腦炎病毒NS3蛋白與宿主細胞蛋白相互作用的驗證
　　本研究運用了免疫共沉淀技術(shù)驗證宿主互作蛋白與乙腦病毒NS3蛋白的相互作用。首先提取人腎上皮細胞（293細胞）的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以該cDNA為模板分別擴增出了8個互作蛋白的編碼基因，并插入真核表達載體pCMV-HA構(gòu)建了真核表達質(zhì)粒。同時將乙腦NS3基因插入另一真核表達載體pEGFP構(gòu)建了pEGFP-NS3

11、真核表達質(zhì)粒。將這些質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入293細胞進行表達，Western blot結(jié)果顯示乙腦病毒NS3蛋白與6個宿主互作蛋白可以成功表達。
　　將NS3真核表達質(zhì)粒與互作蛋白表達質(zhì)粒一對一組合，共轉(zhuǎn)染入293細胞，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24h，非變性裂解細胞，收集蛋白。運用免疫磁珠法沉淀蛋白互作復合物，收集共沉淀產(chǎn)物，進行SDS-PAGE與Western blot檢測。結(jié)果顯示宿主細胞中的熱激蛋白Hsp40(DNAJB6)可與乙腦病毒NS3蛋白