bFGF激活PI3K信號通路調控大鼠胚胎干細胞自我更新.pdf

1、胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）是來源于囊胚期胚胎內細胞團的細胞。胚胎干細胞能根據細胞外不同的信號，分化成不同類型的細胞，因此成為了研究再生醫(yī)學和人類疾病的強有力的工具。目前，盡管已經證明能從多個物種（包括小鼠、大鼠、人、猴等）中獲取ES細胞，但只有小鼠和大鼠的ES細胞被證明能在體外培養(yǎng)條件下具有形成嵌合體動物和保持生殖細胞遺傳能力。與最為常用的實驗動物小鼠相比，大鼠具有個體大，實驗操作方便等優(yōu)勢，因而被

2、廣泛的應用于生理學、行為學和藥理學以及毒性測試等實驗中。然而常用的小鼠ES細胞的培養(yǎng)條件無法分離培養(yǎng)獲取大鼠胚胎干細胞，在小鼠中常用的基因敲除技術構建動物模型的方法在大鼠中無法實現(xiàn)，所以大鼠的應用受到了極大的限制。因而體外維持大鼠ES細胞的自我更新顯得尤為重要。
　　近年來的研究表明維持真正胚胎干細胞系的培養(yǎng)或許可以通過控制幾個信號途徑從而維持干細胞保持在一個未分化的狀態(tài)。例如，小鼠胚胎干細胞在無飼養(yǎng)層培養(yǎng)條件下通過白血病抑制因子

3、（Leukemia Inhibitor Factor，LIF）和兩個小分子抑制劑2i（PD0325901和CHIR99021）的協(xié)同作用就能維持自我更新。同時LIF/2i的條件也可以維持大鼠ES細胞的自我更新，只是大鼠胚胎干細胞自我更新仍需要飼養(yǎng)層細胞的支持。飼養(yǎng)層細胞一般會分泌LIF、堿性成纖維細胞生長因子（basic Fibroblast Growth Factor，bFGF）等細胞因子。LIF可通過STAT3信號通路進而促進小鼠E

4、S細胞的自我更新。bFGF主要對人胚胎干細胞的自我更新有促進作用。而人胚胎干細胞與小鼠Epiblast來源的細胞更為相似，被認為處于發(fā)育較晚的primed state。不過，最近多篇文獻在嘗試培養(yǎng)人以及獼猴na?ve iPSCs時發(fā)現(xiàn)bFGF信號通路對na?ve state胚胎干細胞也有調控作用。但飼養(yǎng)層細胞中分泌的bFGF是否能促進大鼠ES細胞的自我更新，這一問題并不清楚。
　　本課題利用無飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)條件，在LIF加2I的基

5、礎上，對bFGF在大鼠ES細胞自我更新中的作用進行了探索，分析bFGF是否能調控大鼠胚胎干細胞的自我更新及其可能的下游信號通路。
　　第一部分：bFGF調控大鼠ES細胞的自我更新
　　將大鼠胚胎干細胞分別培養(yǎng)于含有或不含bFGF的無血清培養(yǎng)液中，通過堿性磷酸酶染色、免疫熒光以及RT-PCR分析大鼠胚胎干細胞標志基因的表達和多能性。Western Blot檢測bFGF對大鼠胚胎干細胞PI3K信號的激活作用。利用小分子化合物抑制

6、bFGF激活的信號通路，觀察bFGF信號通路激活或抑制后大鼠胚胎干細胞的生長狀態(tài)。結果表明，在LIF加2I的基礎上，bFGF能明顯促進大鼠胚胎干細胞在無飼養(yǎng)層條件下的自我更新。大鼠胚胎干細胞在此條件下能維持干性標志基因Oct-4，Nanog的表達，同時也保持了向不同胚層細胞分化的能力。Western Blot結果顯示bFGF能促進PI3K的磷酸化，小分子化合物直接抑制bFGF或PI3K信號通路均能抑制bFGF對大鼠胚胎干細胞自我更新的促

7、進作用。這些說明bFGF通過激活大鼠胚胎干細胞PI3K相關的信號通路促進大鼠胚胎干細胞自我更新。
　　第二部分：無飼養(yǎng)層細胞條件下大鼠ES細胞的原代分離和培養(yǎng)
　　將DA大鼠發(fā)育至4.5天的囊胚分離，在LIF+2i+bFGF和無飼養(yǎng)層的條件下培養(yǎng)，結果顯示，LIF+2i+bFGF能維持囊胚生長并逐漸形成克隆和傳代培養(yǎng)，而沒有添加bFGF的條件下，囊胚沒有形成明顯的細胞克隆。結合第一部分的結果表明LIF+2i+bFGF不僅能維