SPT抑制劑多球殼菌素對(duì)油酸誘導(dǎo)的HSC凋亡及自噬的影響.pdf

1、目的：探討多球殼菌素阻斷神經(jīng)酰胺從頭合成途徑關(guān)鍵酶絲氨酸棕櫚酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(Serine palmitoyl-CoAtransferaseSPT)對(duì)油酸誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡與自噬的影響。
　　方法：體外培養(yǎng)HSC-T6細(xì)胞，應(yīng)用不同濃度的油酸（(0uM、50uM、100uM、200uM、400uM、600uM）培養(yǎng)HSC-T6細(xì)胞24h，采用MTT法檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞的增殖活力。篩選出能抑制HSC-T6細(xì)胞增殖發(fā)揮抑制作用且無(wú)明顯

2、細(xì)胞毒性的最適濃度(100uM)，進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、油酸處理組(OA組）和不同濃度（50、100、150umol/L）Myriocin組，除對(duì)照組外，其余組均予以油酸
　?。?00umol/L）共培養(yǎng)HSC-T6細(xì)胞24h。
　　1、利用MTT法檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞的增殖活力。
　　2、通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞凋亡率。
　　3、MDC染色法，觀察熒光顯微鏡下HSC-T6細(xì)胞自噬溶酶體形態(tài)改

3、變。
　　4、利用Real-time PCR檢測(cè)SPTLC2mRNA的表達(dá)。
　　5、利用Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax的表達(dá)。
　　6、利用Western blot檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞的標(biāo)志性自噬蛋白Atg5、Beclin-1、LC3B的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、油酸抑制HSC-T6細(xì)胞增殖，且具有濃度依賴(lài)性。
　　2、正常對(duì)照組、油酸處理組及不同濃度（50、100、1

4、50umol/L） Myriocin作用于HSC-T6細(xì)胞，多球殼菌素組HSC-T6細(xì)胞凋亡率高于正常對(duì)照組（P＜0.05），但低于油酸處理組（P＜0.05），且具有濃度依賴(lài)性。
　　3、熒光顯微鏡結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，油酸組及多球殼菌素組的自噬溶酶體明顯增多，前者較明顯；油酸組及多球殼菌素組相比，后者的自噬溶酶體明顯減少，且具有濃度依賴(lài)性。
　　4、與正常對(duì)照組比，油酸處理組SPTLC2mRNA表達(dá)水平增高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

5、（P＜0.01），加入Myriocin后，SPTLC2mRNA表達(dá)水平較油酸處理組下降（P＜0.05），且具有濃度依賴(lài)性。
　　5、與正常對(duì)照組相比，油酸上調(diào)促凋亡蛋白，Bax表達(dá)明顯增加（P＜0.01），而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)則明顯下降（P＜0.01），多球殼菌素處理后可逆轉(zhuǎn)油酸對(duì)HSC-T6細(xì)胞的促凋亡作用，且具有濃度依賴(lài)性。
　　6、正常對(duì)照組、油酸處理組及不同濃度（50、100、150umol/L） Myrioc