Sox2基因對綿羊體細胞克隆不同供體細胞表觀遺傳修飾的影響.pdf

1、分類號 TP391.41 學校代碼 10129 U D C 35.140 學 號 2013211016 Sox2 基因對綿羊體細胞克隆不同供體細胞表觀遺傳修飾的影響 Effect of Sox2 Gene on the Epigenetic Modification of Different Don

2、or Cells in Sheep Somatic Cell Nuclear Transfer 申 請 人： 劉懷禹 學生類別： 學術型碩士 學科門類： 理 學 學科專業(yè)： 發(fā)育生物學 研究方向： 動物遺傳與發(fā)育 指導教師： 張焱如 教授 論文提交日期：二〇一六年六月 摘 要 哺乳動物體細胞克隆技術自誕生以來，發(fā)展迅速且日益趨于成熟，但體細胞克隆效率低始終是制約其在畜牧業(yè)生產(chǎn)中應用與發(fā)展的瓶頸。核不完全重編程及供體細胞的類型與克

3、隆效率密切相關。表觀遺傳修飾中 DNA 甲基化、組蛋白乙?；怯绊懞酥鼐幊痰年P鍵因素。 研究證實， sox2 基因對維持細胞多能性及胚胎著床后的發(fā)育起關鍵的作用，以高表達 sox2 基因的神經(jīng)干細胞為核供體進行核移植時具有較高的克隆效率。 為此，本研究以內蒙古地區(qū)優(yōu)勢畜種綿羊為實驗對象，選擇綿羊骨髓間充質干細胞（Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells, BMSCs） 、脂肪間充質干細胞（Ad

4、ipose-derived Stromal Cells ,ADSCs）和皮膚成纖維細胞 （Sheep Epidermal Fibroblast Cells ,SEFCs）為核供體，經(jīng)電轉染將 sox2 基因導入 BMSCs 和 ADSCs 和SEFCs，檢測 sox2 基因對三類核供體細胞 DNA 甲基轉移酶 1（DNA Methyltransferase 1,DNMT1）和組蛋白去乙酰化酶 2（Histone Deacetyl

5、ase 2,HDAC2）基因的表達水平，分析了 sox2 基因對三類核供體細胞表觀遺傳修飾的影響。同時以導入 sox2 基因的BMSCs 為核供體構建重構胚， 以 SEFCs 核供體構建的重構胚為對照， 分析了 sox2 基因對重構胚表觀遺傳修飾及發(fā)育能力的影響。主要研究結果如下： （1） 分離得到了綿羊 BMSCs、 ADSCs 和 SEFCs 細胞系， 三類細胞生長曲線均呈 “S”型；經(jīng) RT-PCR 檢測，BMSCs 和 ADS

6、Cs 均表達了干細胞特異因子 Sox2、Oct4 和 Nanog基因。 （2）構建了 pEGFPS-N1-Sox2 真核表達載體，對 BMSCs、ADSCs 和 SEFCs 三類細胞進行了電轉染，經(jīng)篩選得到過表達 sox2 基因細胞株，經(jīng)實時定量 PCR 檢測，三種過表達sox2基因細胞株中的DNMT1和HDAC2 基因表達量表現(xiàn)出不同程度的下降， DNMT1分別下降多少 68%、25%、43%；HDAC2 下降了 15%左右。 （3）

7、以過表達 sox2 基因 BMSCs 為核供體，構建重構胚 159 個，以 SEFCs 為核供體構建重構胚 182 個。檢測兩類重構胚中 DNMT1 和 HDAC2 的表達量，過表達 sox2 基因 BMSCs 為供體的克隆胚比以 SEFCs 構建的克隆胚中 DNMT1 和 HDAC2 的表達量低 50%左右，由此推測 sox2 基因的過表達可能有利于克隆胚核的重編程，進而促進重構胚的發(fā)育。 以上結果對闡明 sox2 基因影響不同核供體