放射性食管炎患者消化道菌群結(jié)構(gòu)多樣性研究.pdf

1、研究背景:
　　放射性食管炎是當(dāng)前胸部腫瘤放療過(guò)程中的常見(jiàn)并發(fā)癥。疾病的主要病理改變?yōu)槭彻莛つな芊派渚€照射后出現(xiàn)的局部充血、水腫，隨病情進(jìn)展進(jìn)一步表現(xiàn)為食管局部狹窄，瘢痕樣改變。與之相對(duì)應(yīng)，患者表現(xiàn)出進(jìn)食不適，胸骨后燒灼感、胸部疼痛等臨床癥狀。當(dāng)前放射性食管炎的診斷以臨床癥狀為診斷依據(jù)，缺乏特異性診斷指標(biāo)、有效的評(píng)估手段。放射性食管炎的發(fā)病以及病情進(jìn)展與放射劑量成正相關(guān)改變。放射性食管炎不僅直接影響患者生活質(zhì)量，提高食管氣管瘺等放

2、射相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生率，亦可影響患者遠(yuǎn)期治療效果。
　　隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合宏基因組學(xué)的技術(shù)路線分析人體微生物菌落結(jié)構(gòu)變化與疾病的發(fā)生相關(guān)性研究已廣泛展開(kāi)，當(dāng)前大部分研究以糞便為標(biāo)本研究消化道微生物展開(kāi)，關(guān)注消化道微生物與代謝性疾病及消化道疾病的相關(guān)性。食管作為消化道的重要組成部分，已有相關(guān)研究證明食管內(nèi)存在豐富的菌群分布。食管微生物群落構(gòu)成的改變與真菌性食管炎、反流性食管炎等疾病的發(fā)生、發(fā)展存在直接聯(lián)系。作

3、為胸部腫瘤放療過(guò)程中的常見(jiàn)并發(fā)癥，放射性食管炎放療過(guò)程中菌群結(jié)構(gòu)的改變尚不明確，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分析放射性食管炎患者菌群結(jié)構(gòu)及多樣性特征的研究也未見(jiàn)報(bào)道。
　　研究目的:
　　應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合生物信息分析技術(shù)探究放射性食管炎患者消化道菌群多樣性特征;探究放療對(duì)消化道菌群結(jié)構(gòu)改變的影響并尋找與放射性食管炎疾病相關(guān)的特異菌種;為探索放射性食管炎新的預(yù)防與治療方式提供理論指導(dǎo)。
　　材料與方法:
　　本研究中采

4、用糞便菌群代表消化道菌群，分三個(gè)時(shí)間段采集標(biāo)本:一為患者入院未行任何治療前;二為患者放療過(guò)程中出現(xiàn)放射性食管炎癥狀且未行對(duì)癥治療前;三為放療治療結(jié)束后。同時(shí)收集健康人群糞便作為對(duì)照。本研究收集32例放射性食管炎患者糞便樣本作為試驗(yàn)組，同時(shí)收集41例健康人群糞便標(biāo)本作為對(duì)照組。
　　主要實(shí)驗(yàn)步驟方法如下:
　　1.基因片段獲取:采用物理破碎結(jié)合化學(xué)裂解的方法提取樣本中的細(xì)菌DNA，利用特異性內(nèi)切酶提取細(xì)菌的16S rDNA片段

5、。
　　2.擴(kuò)增基因片段:利用軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)針對(duì)16S rRNA序列的高變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。
　　3.測(cè)序:利用454焦磷酸高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)16S rRNA序列的可變區(qū)擴(kuò)增子進(jìn)行高通量測(cè)序，獲取原始數(shù)據(jù)。
　　4.物種注釋:分析原始數(shù)據(jù)，鑒定細(xì)菌操作分類(lèi)單元（OTUs，相當(dāng)于種的水平），根據(jù)OTU相似性進(jìn)行分類(lèi)得到菌種分布，與細(xì)菌基因文庫(kù)比對(duì)明確各菌種對(duì)應(yīng)的細(xì)菌類(lèi)型。
　　5.統(tǒng)計(jì)分析:

6、應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)得到菌種分布的稀釋曲線、Chao1曲線、Shannon曲線等進(jìn)行樣本內(nèi)復(fù)雜度分析（α多樣性），評(píng)估測(cè)序有效性及樣本內(nèi)的菌種分布。通過(guò)主坐標(biāo)分析(PCoA)和UPGMA聚類(lèi)分析進(jìn)行放射性食管炎患者與健康人群菌群結(jié)構(gòu)的樣本間比較分析（β多樣性），尋找與疾病相關(guān)特異性菌種。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)過(guò)對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)的預(yù)處理，各樣本數(shù)據(jù)均滿足后續(xù)分析要求，通過(guò)α多樣性分析證實(shí)各樣本測(cè)序深度足以覆蓋樣本內(nèi)菌群分布，各組樣本

7、豐度及均勻度均好。
　　2.高通量測(cè)序結(jié)果顯示放射性食管炎患者的菌群多樣性與健康人群存在明顯差異。放射治療前后患者消化道菌群存在明顯差異。
　　3.放射性食管炎患者消化道菌群的主要組成有厚壁菌門(mén)、擬桿菌、變形菌門(mén)、梭菌屬、放線菌、藍(lán)藻菌門(mén)、軟壁菌門(mén)。其菌種構(gòu)成與健康人相似，但其菌種豐度存在明顯差異。
　　4.不同原發(fā)疾病的放射性食管炎患者消化道菌群構(gòu)成未見(jiàn)明顯差異。
　　結(jié)論:
　　1、放射性食管炎患者消化