放射性食管炎患者消化道菌群結構多樣性研究.pdf

1、研究背景:
　　放射性食管炎是當前胸部腫瘤放療過程中的常見并發(fā)癥。疾病的主要病理改變?yōu)槭彻莛つな芊派渚€照射后出現(xiàn)的局部充血、水腫，隨病情進展進一步表現(xiàn)為食管局部狹窄，瘢痕樣改變。與之相對應，患者表現(xiàn)出進食不適，胸骨后燒灼感、胸部疼痛等臨床癥狀。當前放射性食管炎的診斷以臨床癥狀為診斷依據(jù)，缺乏特異性診斷指標、有效的評估手段。放射性食管炎的發(fā)病以及病情進展與放射劑量成正相關改變。放射性食管炎不僅直接影響患者生活質量，提高食管氣管瘺等放

2、射相關并發(fā)癥的發(fā)生率，亦可影響患者遠期治療效果。
　　隨著分子生物學的發(fā)展，運用高通量測序技術結合宏基因組學的技術路線分析人體微生物菌落結構變化與疾病的發(fā)生相關性研究已廣泛展開，當前大部分研究以糞便為標本研究消化道微生物展開，關注消化道微生物與代謝性疾病及消化道疾病的相關性。食管作為消化道的重要組成部分，已有相關研究證明食管內(nèi)存在豐富的菌群分布。食管微生物群落構成的改變與真菌性食管炎、反流性食管炎等疾病的發(fā)生、發(fā)展存在直接聯(lián)系。作

3、為胸部腫瘤放療過程中的常見并發(fā)癥，放射性食管炎放療過程中菌群結構的改變尚不明確，通過高通量測序技術分析放射性食管炎患者菌群結構及多樣性特征的研究也未見報道。
　　研究目的:
　　應用高通量測序技術結合生物信息分析技術探究放射性食管炎患者消化道菌群多樣性特征;探究放療對消化道菌群結構改變的影響并尋找與放射性食管炎疾病相關的特異菌種;為探索放射性食管炎新的預防與治療方式提供理論指導。
　　材料與方法:
　　本研究中采

4、用糞便菌群代表消化道菌群，分三個時間段采集標本:一為患者入院未行任何治療前;二為患者放療過程中出現(xiàn)放射性食管炎癥狀且未行對癥治療前;三為放療治療結束后。同時收集健康人群糞便作為對照。本研究收集32例放射性食管炎患者糞便樣本作為試驗組，同時收集41例健康人群糞便標本作為對照組。
　　主要實驗步驟方法如下:
　　1.基因片段獲取:采用物理破碎結合化學裂解的方法提取樣本中的細菌DNA，利用特異性內(nèi)切酶提取細菌的16S rDNA片段

5、。
　　2.擴增基因片段:利用軟件設計擴增引物，應用聚合酶鏈式反應(PCR)針對16S rRNA序列的高變區(qū)進行擴增。
　　3.測序:利用454焦磷酸高通量測序平臺對16S rRNA序列的可變區(qū)擴增子進行高通量測序，獲取原始數(shù)據(jù)。
　　4.物種注釋:分析原始數(shù)據(jù)，鑒定細菌操作分類單元（OTUs，相當于種的水平），根據(jù)OTU相似性進行分類得到菌種分布，與細菌基因文庫比對明確各菌種對應的細菌類型。
　　5.統(tǒng)計分析:

6、應用生物信息學技術得到菌種分布的稀釋曲線、Chao1曲線、Shannon曲線等進行樣本內(nèi)復雜度分析（α多樣性），評估測序有效性及樣本內(nèi)的菌種分布。通過主坐標分析(PCoA)和UPGMA聚類分析進行放射性食管炎患者與健康人群菌群結構的樣本間比較分析（β多樣性），尋找與疾病相關特異性菌種。
　　結果:
　　1.經(jīng)過對下機數(shù)據(jù)的預處理，各樣本數(shù)據(jù)均滿足后續(xù)分析要求，通過α多樣性分析證實各樣本測序深度足以覆蓋樣本內(nèi)菌群分布，各組樣本

7、豐度及均勻度均好。
　　2.高通量測序結果顯示放射性食管炎患者的菌群多樣性與健康人群存在明顯差異。放射治療前后患者消化道菌群存在明顯差異。
　　3.放射性食管炎患者消化道菌群的主要組成有厚壁菌門、擬桿菌、變形菌門、梭菌屬、放線菌、藍藻菌門、軟壁菌門。其菌種構成與健康人相似，但其菌種豐度存在明顯差異。
　　4.不同原發(fā)疾病的放射性食管炎患者消化道菌群構成未見明顯差異。
　　結論:
　　1、放射性食管炎患者消化