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文檔簡介
1、本文從動物實驗及細胞實驗兩方面,觀察AngⅡ?qū)ν脛用}斑塊形成的影響,離體VSMC的形態(tài)與功能的作用,以及與膠原蛋白、PAPPA、MMP-9等相關(guān)蛋白的關(guān)系,來探討AngⅡ在粥樣硬化斑塊形成和破裂中的作用機制。 第一部分: AngⅡ?qū)ν肁S斑塊的影響及纈沙坦的干預(yù)作用 目的: 通過高脂飼料喂養(yǎng)兔,并給予AngⅡ及纈沙坦干預(yù).觀察兔血脂的變化及AS斑塊形成情況,以探討AngⅡ?qū)ν醚癆S斑塊形成的影響及其作用機制,
2、同時探討纈沙坦降低血脂,減輕AS斑塊形成的作用。 方法: 1、實驗采用雄性新西蘭純種大白兔24只,隨機分為四個組:1)對照組:普通飼料飼養(yǎng);2)高脂組:單純高脂飼料喂養(yǎng);3)AngⅡ組:高脂飼料喂養(yǎng),同時注射AngⅡ,每次劑量為500ng/kg,每周注射3次;4)纈沙坦組:高脂飼料喂養(yǎng),同時以3 mg/Kg/d纈沙坦灌胃,每日給藥1次。 2、試驗開始前、試驗后4周、8周和12周4個時間點分別測體重1次;試驗前及1
3、2周時分別取外周血測血脂。 3、HE染色觀察主動脈病理學(xué)改變,斑塊形成情況,以及內(nèi)膜與中層厚度。 4、免疫組織化學(xué)檢測MMP-9蛋白的表達水平。 5、RT-PCR法檢測MMP-9 mRNA的表達。 6、統(tǒng)計學(xué)分析:用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料數(shù)據(jù)以x±s(均數(shù)±標準差)表示,相同樣本接受兩次以上的不同處理采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析,兩組間均數(shù)比較以獨立樣本t檢驗進行,多組間均數(shù)比較以O(shè)
4、NE-WayANOVA進行,4組MMP-9的免疫組化比較采用Kruskall-Willis方法。P<0.05認為有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果: 1、兔總體生長良好。實驗過程中共有3只兔死亡,實際用于結(jié)果分析的共21只。4周及8周,兔體重,高脂組>AngⅡ組>纈沙坦>對照組(P<0.01);12周時,纈沙坦>對照組>高脂組>AngⅡ組(P<0.01)。0周時總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白3項指標各實驗組之間比較均無明顯差異(P>
5、0.05);12周時,AngⅡ組>高脂組>纈沙坦>對照組(P<0.01)。 2、血管的形態(tài):對照組主動脈色澤紅潤,管腔光滑,內(nèi)膜、中膜完整,無脂質(zhì)沉積。高脂組內(nèi)膜增厚新月形隆起,內(nèi)皮細胞脫落,內(nèi)膜下泡沫細胞,與中膜的分界模糊,中膜萎縮變薄,VSMC減少。AngⅡ組內(nèi)膜斷裂,內(nèi)皮細胞脫落,新生內(nèi)膜形成,內(nèi)膜明顯增厚形成粥樣斑塊,內(nèi)含有大量的泡沫細胞及脂質(zhì)核心,嚴重者斑塊融合成片,部分出現(xiàn)潰瘍糜爛,中膜明顯萎縮,膠原纖維呈玻璃樣變性
6、;纈沙坦組血管內(nèi)膜增厚,內(nèi)膜內(nèi)皮細胞仍存在,內(nèi)膜和中膜的分層較清晰。 5、斑塊發(fā)生率:AngⅡ組>高脂組>纈沙坦組(P<0.01);對照組未發(fā)現(xiàn)斑塊形成。 6、血管內(nèi)膜厚度:AngⅡ組>高脂組>纈沙坦組>對照組(P<0.05)。中層厚度:AngⅡ組<高脂組/纈沙坦組<對照組(P<0.05),高脂組與纈沙坦組無明顯差異(P>0.05)。內(nèi)膜厚度/中層厚度:AngⅡ組>高脂組>纈沙坦組>對照組(P<0.05)。 7、
7、免疫組化MMP-9陽性統(tǒng)計:將MMP-9的表達量化后進行統(tǒng)計,AngⅡ組>高脂組>纈沙坦組>對照組(P<0.05)。 8、MMP-9 mRNA表達量:AngⅡ組>高脂組>對照組>纈沙坦組(P<0.01)。 結(jié)論: 1、兔可以作為研究AS斑塊的良好動物模型,高脂飼料喂養(yǎng)可以模擬出AS斑塊,AngⅡ可以促進和加劇AS斑塊的形成。 2、AngⅡ可以促使主動脈中層VSMC向內(nèi)膜遷移,導(dǎo)致血管內(nèi)膜增厚,出現(xiàn)血管狹窄
8、。 3、AngⅡ可以誘導(dǎo)兔MMP-9 mRNA的高表達,并能增加MMP-9蛋白的分泌。 4、AngⅡ?qū)MP-9的影響與其對斑塊的形成、血管內(nèi)膜增厚血管狹窄的作用一致。 5、AngⅡ受體拮抗劑纈沙坦可以拮抗AngⅡ的上述作用。 第二部分:血管緊張素Ⅱ?qū)ρ芷交〖毎挠绊?目的: 通過觀察AngⅡ?qū)﹄x體VSMC數(shù)量變化、粘附能力、遷移能力、增殖功能以及分泌功能的影響,并給予纈沙坦干預(yù),以探
9、討AngⅡ在AS斑塊形成過程中對VSMC的作用,以及纈沙坦對AngⅡ的拮抗作用。 方法: 1、細胞原代培養(yǎng):取新鮮臍帶15-20cm,將中膜平滑肌層剪成1-2m㎡的組織塊,進行細胞原代培養(yǎng)。實驗用4-8代VSMC,實驗前用無血清的DMEM培養(yǎng)液饑餓使細胞同步。 2、濃度效應(yīng)實驗: 1)對照組:VSMC用含0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),不加特殊試劑; 2)不同濃度AngⅡ組:VSMC分別用含
10、不同濃度(10-7,10-6,10-5和10-4mol/L)的AngⅡ的0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48h收集細胞 3)纈沙坦組:VSMC先在含纈沙坦(10-5 mol/L)的0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中孵育1h后,加入10-5mol/L的AngⅡ共同孵育48h,收集細胞。 3、時間效應(yīng)實驗: VSMC在10-5mol/L的AngⅡ培養(yǎng)液中,分別培養(yǎng)0h、12h、24h、48h、72h后收集細胞,
11、進行各項測定。 4、分別運用計數(shù)法檢測各組VSMC的數(shù)量,貼壁法檢測粘附能力,Boyden小室法檢測細胞遷移能力,MTT比色法檢測細胞增殖能力,RT-PCR法檢測細胞分泌能力(以Ⅰ型膠原與β-actin灰度比值代表Ⅰ型膠原mRNA相對表達量)。 5、統(tǒng)計學(xué)處理:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料數(shù)據(jù)以x±s(均數(shù)±標準差)表示,相同樣本接受兩次以上的不同處理采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析,多組間均數(shù)比較以O(shè)N
12、E-Way ANOVA進行,兩組間均數(shù)比較以獨立樣本t檢驗進行。P<0.05認為有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論: 1、AngⅡ在體外能呈濃度和時間依賴性地增加VSMC的數(shù)量。 2、AngⅡ在體外能改善VSMC的粘附、遷移、增殖能力,在一定的范圍內(nèi)這種作用呈濃度和時間依賴性。 3、AngⅡ在一定范圍內(nèi)呈濃度、時間依賴性刺激VSMCⅠ型膠原的mRNA的表達。 4、AngⅡ受體拮抗劑纈沙坦能夠抑制AngⅡ的上述各
13、種作用。 第三部分:血管緊張素Ⅱ?qū)S斑塊穩(wěn)定性作用機制的研究 目的: 通過觀察不同AngⅡ濃度以及不同AngⅡ作用時間對Ox-LDL刺激過的VSMC PAPP-A、MMP-9的分泌情況,并給予纈沙坦干預(yù),以探討AngⅡ在AS斑塊形成與斑塊破裂中的作用機制,以及纈沙坦對AngⅡ的拮抗作用。 方法: 1、AngⅡ?qū)θ四歏SMC的影響。分組:1)對照組:VSMC用DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng);2)無Ox-LD
14、L組:含AngⅡ的DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng);3)Ox-LDL組:Ox-LDL刺激6h,含AngⅡ的DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)。 濃度效應(yīng)的研究:應(yīng)用不同終濃度(10-7mol/L,10-6moUL,10-5mol/L,104mol/L)的AngⅡ分別刺激2)組、3)組,24小時收集細胞。 時間效應(yīng)的研究:應(yīng)用10-5mol/L的AngⅡ分別刺激2)組、3)組,共同培養(yǎng)0h,6h,12h,24h,36h,48h后收集細胞。
15、2、纈沙坦對AngⅡ的干預(yù)作用 將VSMC用10-5mol/LOx-LDL及AngⅡ進行孵育,并以纈沙坦進行干預(yù)。分組:1)對照組:DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng);2)Ox-LDL組:含終濃度為10-5mol/L的Ox-LDL的DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng);3)AngⅡ組:含終濃度分別為10-5mol/L的Ox-LDL與AngⅡ的DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng);4)纈沙坦組:含終濃度分別為10-5mol/L的Ox-LDL、AngⅡ及纈沙坦的DMEM全培養(yǎng)基
16、培養(yǎng)。24小時后收集細胞和上清液,分別行RT-PCR及ELISA檢測。 3、統(tǒng)計學(xué)處理:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料數(shù)據(jù)以x±s(均數(shù)±標準差)表示,相同樣本接受兩次以上的不同處理采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析,多組間均數(shù)比較以O(shè)NE-Way ANOVA進行,兩組間均數(shù)比較以獨立樣本t檢驗進行。P<0.05認為有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論: 1、在高脂的環(huán)境中,AngⅡ可以誘導(dǎo)VSMC PAPP-A、I
17、GF-1的mRNA高度表達,并能增加PAPP-A、IGF-1蛋白的分泌,這種誘導(dǎo)作用在一定的范圍內(nèi)與AngⅡ存在劑量依賴性和作用時間依賴性。 2、在高脂的環(huán)境中,AngⅡ可以誘導(dǎo)VSMC MMP-9的mRNA高表達,并能增加PAPP-A蛋白的分泌,同時可以抑制VSMC TIMP-1 mRNA的表達,并能減少TIMP-1蛋白的分泌,這種誘導(dǎo)作用在一定的范圍內(nèi)與AngⅡ存在劑量劑量依賴性和作用時間依賴性。 3、AngⅡ受體拮
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