HSP27對心臟衰老的延緩作用及機制研究.pdf

1、背景：
　　由于當今社會正朝著老齡化社會不斷演變，因此關(guān)注老齡化相關(guān)疾病的研究顯得格外重要。心血管循環(huán)系統(tǒng)是維持人體正常生命活動的重要組成部分，然而心臟的再生能力十分有限，隨著年齡的增長，心臟的收縮舒張功能逐漸衰退，這使得心臟逐漸難以維持其正常的泵血功能。因此，延長心臟衰老，維持心臟收縮舒張的泵血功能成為一個十分有意義的研究方向。
　　研究表明，心臟衰老的發(fā)病機制涉及多個分子機制，包括氧化應激、自噬障礙，代謝變化，鈣平衡調(diào)節(jié)

2、障礙，和神經(jīng)內(nèi)分泌通路的激活等。心肌細胞終末分化的性質(zhì)使得這些細胞內(nèi)受損的大分子和細胞器特別容易積累，這就意味著需要增加自噬的激活來清理這些有害細胞的“垃圾”，以維持細胞的穩(wěn)態(tài)。不幸的是，心肌細胞自噬活性隨著年齡的增長而下降，而細胞自噬的受損具有多重不良后果，包括降低心臟收縮功能和增加心律失常的風險等。隨著年齡的增長，心臟中活性氧(reactive oxygen species ROS)的含量也隨之增加，老化的心肌細胞內(nèi)的ROS主要由受

3、損的線粒體所產(chǎn)生的，與此同時ROS的異常蓄積亦會引起線粒體損傷，最終導致細胞的凋亡。由此可見線粒體是ROS生成的主要來源細胞器同時也是ROS攻擊的靶細胞器。由于心肌細胞對線粒體能量代謝的高度依賴性，使得心臟在整個生命周期內(nèi)都暴露在ROS的高負荷中。所以在一定程度下清除ROS，即抗氧化作用是延緩心臟衰老的有效措施。
　　線粒體自噬是一個高度選擇的自噬過程，可以促進清除功能障礙或不必要的線粒體。PINK1-Parkin通路是當下研究中

4、較為受到關(guān)注的線粒體自噬途徑。當線粒體膜電位消失，則導致PINK1穩(wěn)定地在線粒體外膜存在，之后則會促進胞內(nèi)E3泛素連接酶Parkin的招募和激活。激活的Parkin可以介導功能障礙的線粒體被自噬體吞噬以進而被選擇性消除。因而通過激活PINK1和Parkin的線粒體自噬可以防止受損線粒體對心肌細胞進一步損傷，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)從而延緩心臟衰老。
　　熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是一類生物體中組織結(jié)構(gòu)高度保守

5、的蛋白質(zhì)，細胞可以由內(nèi)源或者外源性應激源的刺激下誘導產(chǎn)生。熱休克蛋白27(HSP27)是一種廣泛表達于哺乳動物的小熱休克蛋白亞家族的成員，在人類，其分子量為27 kDa，在嚙齒類動物中，其分子量為25 kDa。HSP27除了在細胞分子水平上使錯誤結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)完成正確的折疊和組裝，通過信號轉(zhuǎn)導，調(diào)節(jié)細胞的增殖，分化，凋亡外，還參與了組織在氧化應激、熱休克反應、缺氧/缺血損傷等的調(diào)控。我們研究組和其他研究人員均發(fā)現(xiàn)高表達HSP27可以對抗缺

6、血/再灌注損傷，心肌梗死，炎癥反應，以及阿霉素誘導的心臟損傷，心功能障礙。HSP27對心臟保護的機制涉及抗氧化能力，抑制炎癥反應，提高心肌細胞的存活率，以及自噬激活和提高線粒體活性等。因此，我們提出研究假設:高表達HSP27可以延緩由增齡引起的心臟衰老。
　　目的：
　　在本項研究中，我們通過構(gòu)建在心臟特異表達HSP27的轉(zhuǎn)基因小鼠（Tg），同時選取年齡與之相匹配的野生型小鼠(WT)作為衰老模型的研究對象來探索HSP27對由

7、年齡誘導的心臟衰老的作用及其可能涉及的機制。
　　研究方法和內(nèi)容：
　　1.實驗動物的構(gòu)建
　　在南京大學動物模式所的協(xié)助下，構(gòu)建心肌特異性表達的HSP27轉(zhuǎn)基因小鼠(Tg)，本研究以飼養(yǎng)2年（24個月）的Tg小鼠和性別，年齡與之相匹配的野生型小鼠(WT)作為衰老模型的研究對象。本實驗的實驗動物護理和實驗報告均得到了南京大學動物保護委員會的批準。所有實驗均遵守關(guān)于動物倫理使用的國際準則。
　　2.小鼠心功能的檢測

8、
　　通過Vev0770設備對小鼠進行超聲心動圖測量。在超聲心動圖測量時，2個月月齡的Tg小鼠和性別相匹配的WT小鼠作為青年對照組。通過M-mode型超聲評價小鼠射血分數(shù)等心功能指標，或著通過脈沖多普勒評價二尖瓣功能。最終的實驗數(shù)據(jù)為至少連續(xù)五個心動周期的平均值。
　　3.馬松三色染色
　　將心臟組織收集后，用4％多聚甲醛過夜固定，之后用石蠟包埋，在乳頭肌水平制作成石蠟切片。馬松三色染色法是用來了解心臟纖維化程度的方法

9、。染色后的片子在放大400 x的顯微鏡下觀察，通過計算心室中心肌內(nèi)纖維化的面積比例來評價小鼠心肌纖維化的程度。
　　4.組織免疫熒光
　　收集好小鼠心臟組織標本，用4％多聚甲醛過夜固定，之后用石蠟包埋組織制作成切片后，將切片進行脫蠟、水化，抗原修復和封閉。隨后，將切片上的組織與適當?shù)囊豢乖?℃孵育過夜，第二天選用FITC（綠色熒光）或者Cy3（紅色熒光）標記的二抗在37℃孵育60min。用α-actinin來表示心肌細胞。用

10、Hoechst33342對細胞核進行復染。染色后切片的觀察和圖像的采集通過熒光顯微鏡來完成。
　　5.DCFH檢測
　　通過熒光指示劑DCFH來測定ROS水平。當把DCFH加到組織勻漿中，勻漿中ROS會使得DCFH氧化，生產(chǎn)熒光的DCF。將1uM的DCFH和1毫升含10ug心肌胞漿蛋白一起孵育1h后，使用900Hi型全自動恒溫酶標儀在485nm的激發(fā)波長和535nm的發(fā)射波長下進行檢測。
　　6.蛋白羰基化實驗

11、　　將心室組織在（蔗糖0.3M，煙堿0.03M和EDTA0.02M，pH7.4）液體里勻漿，之后將組織勻漿液在4℃離心機中以10000g離心5 min。每500ul體積中含100ug的胞漿蛋白，和2mM的DNPH常溫避光孵育1h。最后將DNPH處理的蛋白，采用Western blot的方法檢測蛋白質(zhì)的羰基化反應。
　　7.蛋白質(zhì)印跡
　　收集24個月大的老齡小鼠心臟，提取蛋白通過Western blot的方法檢測p16，p5

12、3，LC3，p62，PINK1，Parkin等蛋白水平。GAPDH作為蛋白質(zhì)印跡的內(nèi)參，每組n=3。
　　8.統(tǒng)計分析
　　所有數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。組間比較采用t檢驗或者單因素方差分析，數(shù)據(jù)運用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　研究結(jié)果：
　　1.HSP27減輕由年齡引起的心臟衰老
　　1.1心肌特異性表達HSP27的鑒定
　　我們成功構(gòu)建心肌特異性表達人

13、HSP27基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，通過Westernblot分析來確認，在Tg小鼠心臟中HSP27表達豐富，而野生型對照組中則不表達（HSP27抗體不與小鼠的HSP25交叉反應）。
　　1.2 HSP27對衰老心臟心功能的影響
　　與年輕的WT小鼠相比，老年的WT小鼠的E/A比值減少37.5％，EF(40.0％)和FS(45.9％)明顯下降，與此同時LVVd(67.4％)和LVVs(181.0％)明顯增加(P＜0.01)。與年輕的

14、Tg小鼠相比，老年Tg小鼠的E/A比值減少15.4％(P＜0.05)，而老年Tg小鼠的EF，F(xiàn)S，和LVVd較年輕Tg小鼠相比變化不大。但是，與老齡WT小鼠相比，老齡Tg小鼠減緩(37.4％)由于年齡引起的E/A比值減少(P＜0.05)，高齡Tg小鼠較WT小鼠EF、FS明顯增加，同時LVVd和LVVs明顯降低(P＜0.01)。
　　2.HSP27減少老年小鼠心肌中衰老標志物的水平
　　在小鼠心肌組織中，與老年WT小鼠相比，老

15、年Tg小鼠的p16和p53的水平分別顯著降低46.5％和49.4％（P＜0.01），老年Tg小鼠的p21表達水平比WT老年小鼠心肌中p21的表達水平顯著降低(P＜0.01)。為了確定p53的激活，我們繼續(xù)探究在Ser15位點磷酸化的p53磷酸化水平(p-p53)。在老齡Tg小鼠心臟的p-p53水平比老齡WT小鼠心肌組織中的p-p53明顯降低（P＜0.01）。
　　3.HSP27減緩老年小鼠心肌間質(zhì)的纖維化進程
　　與老齡WT

16、小鼠心臟心肌間質(zhì)相比，老年Tg小鼠心臟心肌間質(zhì)纖維化明顯減少76.2％(P＜0.01)。
　　4.HSP27減少老年小鼠心肌中ROS的含量
　　在老齡的WT小鼠和Tg小鼠的心臟中ROS含量分別為2038.6和752.4個單位，老年Tg小鼠的心臟中ROS含量比老年的WT小鼠顯著降低(P＜0.01)。同時，老齡Tg小鼠心肌的蛋白質(zhì)羰基化水平(46.1％)明顯較老齡的WT小鼠降低（P＜0.01）
　　5.HSP27提高老齡小

17、鼠心臟中的自噬水平
　　與老齡WT小鼠心臟相比，老年Tg小鼠心臟的LC3-Ⅱ蛋白水平明顯降低38.7％(P＜0.01)，p62蛋白表達水平降低59％(P＜0.01)。同時老齡Tg小鼠心臟中參與自噬體形成和成熟的蛋白表達水平較WT高齡小鼠顯著增加:Atg13(112.7％)、Vps34(68.5％)、和Rab7(138.4％)(P＜0.01)。
　　6.HSP27減少泛素結(jié)合蛋白的含量
　　高齡的Tg小鼠心臟的蛋白質(zhì)的泛

18、素化水平(76.2％)比高齡的WT小鼠顯著降低(P＜0.01)。
　　7.HSP27增加PINK1和Parkin在老齡心臟中的表達水平
　　與老齡的WT小鼠心臟相比，老齡Tg小鼠心臟中PINK1和Parkin的表達水平分別增加了57.1％和60.5％(P＜0.01)，高齡Tg小鼠心臟中BNIP3表達水平明顯高于高齡WT小鼠(P＜0.05)。而Nix蛋白的水平在兩組基因型不同的高齡小鼠中表達相差不大。
　　結(jié)論：