Glut--1在喉癌Hep--2細胞生長、遷移、化療抵抗中的作用及機制研究.pdf

1、背景和目的：
　　喉鱗狀細胞癌(Laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC)是頭頸部發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，也是第二大呼吸道高發(fā)癌。LSCC一般按照腫瘤大小(Tumor size，T)、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(Cervical lymph node metastasis，N)及遠處轉(zhuǎn)移(Distantmetastasis，M)對其分期。原位癌的淋巴轉(zhuǎn)移直接影響其治療方式、患者生存期，研究報道，LSCC頸

2、部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率分別約為:T16-25％、T230-70％、T3及T465％-80％。一般LSCC預(yù)后不良的因素包括T、N分級升高及出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移等。然而，對于喉鱗狀細胞癌臨床預(yù)后影響因素的相關(guān)文獻報道尚不一致。因此，本研究第一部分旨在研究不同臨床病理因素對LSCC預(yù)后的影響。
　　葡萄糖是腫瘤細胞增殖、分化、侵襲及轉(zhuǎn)移的主要能量來源，細胞對葡萄糖攝取主要依賴葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(glucosetransporter，Glut)，其中Glu

3、t-1是細胞攝取葡萄糖的主要載體。與正常細胞相比，腫瘤細胞自身更偏好于在厭氧環(huán)境中利用糖酵解途徑產(chǎn)生能量，為適應(yīng)腫瘤微環(huán)境，大多數(shù)惡性腫瘤細胞都高表達Glut-1以滿足其能量的需要，因此，Glut-1作為惡性腫瘤基因治療的重要靶點成為近年來腫瘤研究領(lǐng)域的熱點。Glut-1與腫瘤細胞生長、遷移有著密切的關(guān)系。大量研究報道，抑制腫瘤細胞Glut-1的表達能有效抑制惡性腫瘤細胞增殖、遷移、誘導(dǎo)細胞周期阻滯及凋亡。然而，Gult-1抑制對喉癌細

4、胞生長及遷移的影響及其分子機制卻很少被報道。因此，本研究第二部分旨在探討Gult-1敲低對喉癌Hep-2細胞增殖、凋亡、遷移的影響，并通過研究相關(guān)信號通路蛋白及基因的表達探討其分子機制。
　　自噬在腫瘤細胞生長、遷移中起著重要的作用，是一種真核細胞對損壞的蛋白或細胞器進行降解并循環(huán)利用的過程，在腫瘤細胞生長、遷移過程中扮演著促細胞存活與誘導(dǎo)細胞死亡的雙重角色。一定程度的自噬促進腫瘤的生長、侵襲，而過度持續(xù)的自噬可激活腫瘤細胞自我降

5、解從而導(dǎo)致細胞死亡。自噬相關(guān)蛋白Beclin1是細胞發(fā)生自噬的重要標(biāo)志物之一，在誘導(dǎo)自噬開始階段起著重要作用。研究證明調(diào)節(jié)惡性腫瘤細胞Glut-1基因及蛋白的表達可以通過影響細胞自噬通路來調(diào)節(jié)細胞生長、遷移。然而，Gult-1對喉癌自噬的影響及其機制尚缺乏相關(guān)文獻支撐。因此，探索敲低Gult-1及調(diào)節(jié)Beclin1表達在喉癌Hep-2細胞自噬中的作用及其對細胞生長、遷移的回復(fù)效應(yīng)成為本研究的主要目的之一。
　　腫瘤生長的微環(huán)境在腫

6、瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療抵抗、復(fù)發(fā)中具有重要作用，尤其乏氧微環(huán)境和腫瘤治療抵抗、復(fù)發(fā)關(guān)系密切。實體瘤內(nèi)部乏氧微環(huán)境下誘導(dǎo)的新生血管形成、對葡萄糖的攝取和代謝增加是腫瘤對放、化療抵抗的重要原因。在乏氧的情況下HIF-1α表達急劇升高，激活Glut-1中mRNA過度表達及其產(chǎn)物的大量合成，以便轉(zhuǎn)運更多的葡萄糖以滿足惡性腫瘤細胞高代謝率和快速生長的需要，阻斷其中的某些重要環(huán)節(jié)對消除腫瘤治療抵抗與復(fù)發(fā)具有重要作用。而目前Glut-1與喉癌化療耐藥關(guān)

7、系的研究少見。因此，本研究第四部分旨在了解喉癌Hep-2細胞中Glut-1蛋白表達與腫瘤耐藥的關(guān)系，并通過RNA干擾阻斷喉癌Hep-2細胞Glut-1的表達，闡明Glut-1表達改變影響喉癌Hep-2細胞能量供應(yīng)及提高喉癌Hep-2細胞化療敏感性的可能機制。
　　方法：
　　1.回顧性研究2013年1月-2013年12月71例我院首次治療的喉鱗狀細胞癌患者，分析不同性別、年齡、TNM分期、臨床分期、腫瘤位置、病理分化程度、治

8、療方式等因素對患者預(yù)后的影響。
　　2.采用短發(fā)夾RNA（Short hairpin RNA，shRNA）抑制喉癌Hep-2細胞Glut-1蛋白及基因的表達，觀察對細胞增殖、凋亡及遷移的影響，并研究其抑制細胞增殖及遷移、促進細胞凋亡的機制。
　　3.通過雷帕霉素或高表達Beclin1從而促進細胞自噬，研究Glut-1敲低+促進自噬對Hep-2細胞增殖、凋亡及遷移的影響，通過敲低Beclin1從而抑制細胞自噬，研究Glut-1

9、敲低+抑制自噬對Hep-2細胞增殖、凋亡及遷移的影響。以此探討Glut-1在喉癌細胞自噬中的作用及其對細胞生長及遷移的回復(fù)效應(yīng)。
　　4.篩選針對Hep-2細胞有效的Glut-1干擾片段siRNA以及對Hep-2細胞功能影響有效的順鉑濃度;通過RNA干擾抑制Glut-1表達對Hep-2細胞順鉑敏感性的影響，研究Glut-1表達改變影響Hep-2細胞化療敏感性的可能機制。
　　結(jié)果：
　　1.單因素生存分析顯示年齡、T分

10、期、鱗狀細胞癌的分化程度、治療方式對喉鱗狀細胞癌患者的生存率影響較小(P＞0.05)，聲門上型患者的死亡率顯著高于聲門型患者(P＜0.05)，提示聲門上型喉鱗狀細胞癌的預(yù)后較聲門型差;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者其生存率顯著高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，提示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉鱗狀細胞癌其預(yù)后較差(P＜0.01);臨床分期越高，患者死亡率越高，提示喉鱗狀細胞癌臨床分期越高預(yù)后越差（P=0.000）。COX比例風(fēng)險模型回歸分析顯示，僅年齡、治療方式兩個變量對

11、患者預(yù)后的影響有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.Glut-1敲低顯著抑制細胞周期相關(guān)蛋白cyclinD1(27％)及細胞增殖相關(guān)蛋白c-myc(29％)的表達，從而抑制Hep-2的增殖活性（24h、48h、72h分別約為NC組的87.4％、73.2％、55.8％）;Glut-1敲低通過抑制抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白及基因的表達（約23.2％），促進促凋亡相關(guān)的激活的Caspase3蛋白及基因的表達(2.45倍)，從而促進H

12、ep-2細胞發(fā)生凋亡（Glut-1 shRNA、Control、NC組細胞凋亡率分別約為25.9％、3.2％及3.1％）;Glut-1敲低通過上調(diào)抑制細胞遷移相關(guān)蛋白E-cadherin的表達（約2.1倍），下調(diào)促細胞遷移相關(guān)蛋白N-cadherin蛋白及基因的表達（約降低45％），從而抑制喉癌細胞遷移（約降低57.6％）。
　　3.Gult-1敲低能促進細胞自噬，自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素及高表達Beclin1能顯著誘導(dǎo)細胞發(fā)生自噬，自

13、噬誘導(dǎo)能進一步促進Gult-1敲低細胞的自噬水平;在Gult-1敲低的基礎(chǔ)上，過度誘導(dǎo)自噬會進一步降低細胞增殖相關(guān)cyclinD1與c-myc蛋白的表達，進一步降低細胞存活率。在Gult-1敲低的基礎(chǔ)上，誘導(dǎo)自噬能進一步下調(diào)Hep-2細胞抗凋亡相關(guān)Bcl-2，上調(diào)促凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3的表達，從而進一步促進細胞發(fā)生凋亡。在Gult-1敲低的基礎(chǔ)上誘導(dǎo)自噬，能促進抑制細胞遷移E-cadherin蛋白及基因的表達，而

14、抑制促細胞遷移N-cadherin蛋白及基因的表達，從而進一步抑制Hep-2細胞的遷移。反之，敲低Beclin1能顯著抑制細胞自噬，能有效逆轉(zhuǎn)Gult-1敲低引起的細胞自噬水平的升高，能逆轉(zhuǎn)Gult-1敲低引起的細胞增殖活性降低，上調(diào)細胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，有效逆轉(zhuǎn)Gult-1敲低誘導(dǎo)的細胞凋亡，自噬抑制能有效逆轉(zhuǎn)Gult-1敲低誘導(dǎo)的細胞遷移能力降低的效應(yīng)。
　　4.在4組RNA干擾抑制Hep-2細胞Gult-1表達組中

15、，siRNA726組的抑制效果最佳，并同時對MRP1基因產(chǎn)生抑制;在3種不同順鉑濃度對喉癌Hep-2細胞功能影響中，3μg/mL的順鉑濃度對Hep-2細胞抑制增殖、促進凋亡作用效果最好;Hep-2細胞RNA干擾抑制Glut-1表達后可以抑制MRP1基因及蛋白的表達，順鉑可以上調(diào)Hep-2細胞RNA干擾抑制Glut-1表達后MRP1基因及蛋白的表達，且RNA干擾抑制Glut-1對MRP1基因及蛋白的抑制作用大于順鉑的促進作用。
　　

16、結(jié)論：
　　1.年齡、N分期、臨床分期、腫瘤位置、治療方式等因素可能對喉鱗狀細胞癌患者的預(yù)后有一定影響。
　　2.Gult-1的敲低能抑制Hep-2細胞的增殖;促進Hep-2細胞發(fā)生凋亡;抑制Hep-2細胞遷移。
　　3.shRNAGlut-1及誘導(dǎo)自噬可以影響喉癌Hep-2細胞生長、遷移;shRNA Glut-1可以通過影響自噬調(diào)節(jié)喉癌Hep-2細胞生長、遷移。
　　4.RNA干擾抑制Glut-1后可以抑制MR