基于高通量測(cè)序系統(tǒng)研究參與DNA損傷應(yīng)答的lncRNAs.pdf

1、非編碼RNA是指一類不編碼蛋白質(zhì)的RNA，包括miRNAs(microRNAs，微小RNAs)，piRNAs(piwi蛋白相互作用的RNAs)，lncRNAs(long Non-coding RNAs，長(zhǎng)鏈非編碼RNAs)，snoRNAs（small nucleolar RNAs，核糖體小RNAs）等，研究表明，這些非編碼RNA不僅在正常的生長(zhǎng)發(fā)育和生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而且與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近幾年lncRNAs的作用機(jī)制

2、和功能受到了廣泛關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs在維持基因組穩(wěn)定性過(guò)程中起到重要作用。
　　維持基因組的穩(wěn)定性是細(xì)胞發(fā)揮正常功能及維持生命的必要條件。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種可以對(duì)DNA造成損傷的因素存在于生物體內(nèi)部或外部環(huán)境中，這些因素會(huì)破壞基因組的穩(wěn)定性，甚至導(dǎo)致疾病的發(fā)生。DNA損傷修復(fù)能有效維持基因組穩(wěn)定性，保持基因編碼信息不變。若損傷的DNA未被及時(shí)修復(fù)，會(huì)造成維持基因組穩(wěn)定性的重要因子的功能缺失，從而引起基因組的不穩(wěn)定性和基因突

3、變，造成腫瘤抑制基因和致癌基因的突變積累，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)增殖失調(diào)等細(xì)胞生理現(xiàn)象，最終引發(fā)癌癥。
　　研究表明，p53是DNA損傷應(yīng)答(DNA Damage Response，DDR)通路中重要的腫瘤抑制因子，可以維持基因組的穩(wěn)定性，避免突變發(fā)生，并在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、DNA損傷修復(fù)以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等過(guò)程中占據(jù)重要地位。在DNA損傷應(yīng)激條件下，轉(zhuǎn)錄因子p53可以激活引起細(xì)胞周期阻滯的基因或使受損傷的細(xì)胞發(fā)生凋亡，因而維持了細(xì)胞的穩(wěn)定性

4、。近年來(lái)研究顯示，lncRNAs可以維持基因組穩(wěn)定性，并在此過(guò)程中發(fā)揮重要的功能，尤其是在p53影響DNA損傷應(yīng)答信號(hào)通路中發(fā)揮了重要的功能，如Hall等人在小鼠細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)lincRNA-p21可以通過(guò)影響輔抑制物p21的表達(dá)，最終引起p53依賴的DNA損傷后凋亡?；趐53在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的重要作用，參與p53信號(hào)通路lncRNAs的表達(dá)和功能逐漸被人們所關(guān)注。
　　根據(jù)已有的研究，發(fā)現(xiàn)lncRNAs參與p53相關(guān)的DNA損傷

5、應(yīng)答通路主要通過(guò)兩種機(jī)制，一方面，lncRNAs通過(guò)與染色質(zhì)調(diào)控因子相互作用介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制;另一方面，lncRNAs通過(guò)與組蛋白修飾激活因子結(jié)合來(lái)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄激活。由于lncRNAs在DNA損傷應(yīng)答通路中起到至關(guān)重要的作用，研究者們使用不同的策略獲得lncRNAs，并對(duì)它們表達(dá)水平進(jìn)行分析，進(jìn)一步研究lncRNAs在DNA損傷應(yīng)答過(guò)程中的功能。通過(guò)組蛋白修飾、染色質(zhì)調(diào)控因子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合分析，可以對(duì)lncRNAs的功能進(jìn)行初步分析。有研究表明

6、，果蠅中的Dmp53與人類的p53同源，保守性極高。到目前為止，在生物體水平還缺少對(duì)lncRNAs作用機(jī)制的研究，并缺少在模式生物果蠅的功能分析和機(jī)制研究，在果蠅中已有的ChIP-seq數(shù)據(jù)也尚未整理分析。我們通過(guò)RNA-seq技術(shù)分析了果蠅中依賴p53的與DDR相關(guān)的lncRNAs，根據(jù)已有的ChIP-seq數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)據(jù)信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，建立果蠅的ChIP-seq公共數(shù)據(jù)集，為深入研究lncRNAs的功能和作用機(jī)制提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

7、r>　　目的:
　　獲得果蠅中與p53相關(guān)的、參與DNA損傷應(yīng)答的lncRNAs，分析已有的ChIP-seq數(shù)據(jù)信息，建立果蠅中的ChIP-seq公共數(shù)據(jù)庫(kù)。
　　方法:
　　1.將野生型和p53缺失型果蠅胚胎經(jīng)過(guò)DNA損傷處理，提取RNA，進(jìn)行RNA-seq測(cè)序。
　　2.對(duì)RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得DNA損傷應(yīng)答過(guò)程中差異表達(dá)的lncRNAs.
　　3.搜集已有的ChIP-seq數(shù)據(jù)，將已有的數(shù)據(jù)

8、進(jìn)行歸納分類，得到系統(tǒng)的ChIP-seq數(shù)據(jù)體系。
　　4.構(gòu)建差異表達(dá)lncRNAs的突變gRNA質(zhì)粒。
　　結(jié)果和結(jié)論:
　　通過(guò)對(duì)RNA-seq數(shù)據(jù)的分析，獲得了169個(gè)DNA損傷應(yīng)答中差異表達(dá)的lncRNAs;運(yùn)用qPCR技術(shù)對(duì)差異表達(dá)的lncRNAs表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證;構(gòu)建了差異表達(dá)lncRNAs的gRNA質(zhì)粒，用于建立突變果蠅，進(jìn)行體內(nèi)功能研究;收集已有的ChIP-seq數(shù)據(jù)，對(duì)數(shù)據(jù)信息進(jìn)行歸納分析，建立以果