新的UBA家族蛋白TM4在糖尿病血管病變中的作用研究.pdf

1、第一部分 TM4基因的克隆及生物信息學分析
　　 目的:從人主動脈組織中克隆TM4基因,運用生物信息學技術對TM4基因及蛋白進行綜合分析,為下一步研究工作指明方向。
　　 方法:運用RT-PCR技術克隆TM4基因全長,將TM4基因克隆到pDrive載體中,經酶切、測序證實TM4基因序列的正確性,進一步運用生物信息學技術對TM4基因及蛋白的結構、功能等進行分析。
　　 結果:1)TM4基因存在兩個剪切體,其ORF分

2、別為1035bp和915bp,主動脈組織中主要表達長剪切體。2)成功克隆出TM4基因的長剪切體并成功構建序列正確的pDrive-TM4克隆載體。3)生物信息學分析發(fā)現:TM4基因(長剪切體)定位于13q32.3,編碼344個氨基酸,廣泛表達于多種組織;數據庫中尚未出現與TM4基因及蛋白序列完全一致的序列,但其序列與多種物種中的UBAC2(UBA domaincontaining 2)基因及蛋白序列高度同源;TM4蛋白為含有4個穿膜結構袢

3、的膜蛋白,在胞內段第89位絲氨酸殘基上含有PKC磷酸化位點,在C末端含有一個保守的功能結構域－泛素相關結構域(Ubiquitin Associated domain,UBA domain),UBA結構域在不同物種中高度保守;TM4可能是一個參與某種或某些物質轉運的蛋白。
　　 結論:1)TM4是一個廣泛表達于多種組織、存在兩種剪切體的新基因。2)TM4是一個含有4個穿膜結構袢的膜蛋白,UBA結構域對TM4蛋白功能的發(fā)揮可能起重要

4、作用。3)TM4蛋白可能參與物質轉運。
　　 第二部分 TM4基因真核表達載體及腺病毒表達載體的構建及鑒定
　　 目的:構建TM4基因的真核表達載體和腺病毒表達載體,為下一步TM4蛋白功能等研究奠定基礎。
　　 方法:以pDrive-TM4質粒為模板,通過PCR擴增出TM4基因的ORF,將TM4基因克隆到真核表達載體PDC315及PDC315-GFP中,并用酶切、測序證實TM4基因序列的正確性,進一步用PDC31

5、5-GFP-TM4質粒轉染HEK293細胞以證實質粒構建的正確性。以PDC315-6FP-TM4及PDC315-TM4質粒作為穿梭質粒,與含5型腺病毒基因組的輔助質粒pBHGloxE1,3Cre重組包裝腺病毒表達載體,并經PCR及細胞感染證實病毒包裝是否成功。
　　 結果:1)成功構建TM4真核表達載體PDC315-TM4及PDC315-GFP-TM4,經酶切及測序鑒定序列正確,PDC315一GFP-TM4質粒轉染細胞可以正確表

6、達GFP蛋白。2)成功包裝表達TM4基因的重組腺病毒載體,經PCR及細胞感染實驗證實病毒包裝成功。
　　 結論:成功構建TM4真核表達載體及重組腺病毒載體。
　　 第三部分 應用酵母雙雜交篩選TM4蛋白的相互作用蛋白
　　 目的:應用酵母雙雜交技術篩選與TM4蛋白可能存在相互作用的蛋白。
　　 方法:以pDrive-TM4質粒為模板,PCR擴增出TM4基因的ORF,構建重組酵母質粒pGB-TM4,驗證TM

7、4蛋白是否具有自激活報告基因的能力。pGB-TM4誘餌質粒轉化篩庫宿主菌Y190,檢測誘餌基因是否激活報告基因,然后篩選酵母cDNA文庫,鑒定陽性克隆,抽提酵母質粒,篩庫所得獵物(Prey)質粒與誘餌(Bait)質粒共同轉化Y190菌,進一步驗證其相互作用。測序得到陽性克隆序列,數據庫序列比對明確基因。
　　 結果:成功構建pGB-TM4重組質粒,重組質粒沒有自激活報告基因的能力,在cDNA文庫轉化克隆中,得到5個陽性克隆,經測

8、序及blastn比對證實均為NR4A1基因,將Prey質粒與Bait質粒共同轉化Y190菌,可以激活報告基因,提示NR4A1可能為TM4蛋白的相互作用蛋白。
　　 結論:應用酵母雙雜交技術篩選到TM4蛋白的可能相互作用蛋白-NR4A1,為進一步的深入研究奠定了基礎。
　　 第四部分 應用基因誘捕建立TM4基因突變小鼠模型
　　 目的:應用基因誘捕(gene trap)技術建立TM4基因突變小鼠模型,為進一步深入研

9、究TM4功能奠定基礎。
　　 方法:應用基因誘捕方法制備TM4基因突變小鼠模型。從基因誘捕ES細胞庫獲得含TM4基因突變的ES細胞株RRQ018,將ES細胞囊胚顯微注射到C57BL/6J小鼠的囊胚腔中,然后將注射好的囊胚移植到假孕母鼠的輸卵管中。出生仔鼠中毛色嵌合率在50％以上的小鼠為嵌合體小鼠,將雄性嵌合體小鼠與C57BL/6J雌性小鼠交配,留下灰色仔鼠剪尾做基因型分析。獲得的雜合子小鼠為F1代,F1雜合子交配產下F2代小鼠,

10、用PCR方法鑒定小鼠體內的TM4基因是否發(fā)生突變。
　　 結果:獲得9只雄性嵌合體小鼠,其中編號為5號和8號的兩只嵌合體雄鼠可以產下灰色仔鼠。F1代中獲得TM4基因突變雜合子小鼠,F1代雜合子交配獲得的F2代小鼠在DNA水平鑒定證實基因誘捕載體成功插入TM4基因的內含子中,但是在RNA水平發(fā)現TM4基因僅發(fā)生部分突變,即產生TM4基因功能部分性缺失突變,未能產生TM4基因功能完全性缺失突變。
　　 結論:建立TM4基因功

11、能部分性缺失突變小鼠模型,未能建立TM4基因功能完全性缺失突變小鼠模型。
　　 第五部分 TM4蛋白在糖尿病血管損傷中的作用初步研究
　　 目的:研究TM4蛋白在組織和血管細胞中的分布、亞細胞定位;初步研究高糖、AGEs等因素對TM4蛋白表達的影響;初步研究TM4蛋白對細胞增殖的影響;初步研究TM4基因功能部分喪失對Nur77蛋白表達的影響。
　　 方法:1)運用RT-PCR、免疫組化方法研究TM4基因的組織表達

12、譜以及在血管細胞中的表達譜。2)應用激光共聚焦技術觀察TM4蛋白的亞細胞定位。3)應用Westen blot方法觀察高糖、AGEs等因素對TM4蛋白表達的影響。4)用XTT法研究TM4蛋白對細胞增殖的影響。5)用Westen blot技術觀察TM4基因功能部分喪失后對Nur77蛋白表達的影響。
　　 結果:1)TM4基因廣泛表達于體內多種組織,血管內皮細胞、平滑肌細胞以及巨噬細胞中均有TM4表達,TM4蛋白可表達于血管內膜、中膜

13、及外膜。2)TM4蛋白定位于核膜及細胞膜。3)高糖、AGEs、PKC激動劑TPA上調TM4基因的表達,吡咯列酮下調TM4基因的表達。4)過表達TM4促進細胞增殖。5)TM4基因功能部分喪失后Nur77蛋白表達上調。
　　 結論:TM4基因廣泛表達于多種組織,血管內皮、平滑肌及巨噬細胞均表達TM4基因,TM4的表達受高糖、AGEs等因素調控,TM4過表達促進細胞增殖,TM4基因功能部分喪失后Nur77蛋白表達上調。TM4蛋白在糖尿