甲殼素脫乙酰酶產生菌的篩選、cDNA克隆及原核表達研究.pdf

1、論文內容主要分為三個部分，第一部分側重于甲殼素脫乙酰酶(CDA)產生菌的篩選。 本文比較了幾種霉菌：總狀毛霉(Mucor racemosus)、青霉(Penicillium sp.)、曲霉(Aspergillus sp.)、根霉(Rhizopus sp.)菌株在對數(shù)生長末期和穩(wěn)定期末期的細胞內和細胞外CDA的酶活性。結果顯示：(1)各霉菌的胞內和胞外都具有CDA活力，而且胞外的酶活力均大于胞內的酶活力；(2)處于對數(shù)生長期末期的

2、總狀毛霉菌株的CDA活力最高，其胞外酶活力達到97.2±4.2 U·(g干菌絲體)<'-1>，發(fā)酵菌株產酶總活力為83.1±3.6 U，均顯著高于其他菌株(P<0.5)。酶學特性研究表明：該酶的最適溫度為50℃，最適pH在7.2左右，低溫保存(4℃)穩(wěn)定性較差，每24小時酶活力下降30％以上。 第二部分著重從總狀毛霉中克隆CDA基因，并對其序列進行分析。 從處于對數(shù)生長期的總狀毛霉菌絲體中抽提得到總RNA，用已知真菌CD

3、A保守區(qū)設計簡并引物，進行PT-PCR擴增，結合RACE技術，分離和克隆到了2個總狀毛霉CDA的全長cDNA，并進行了全序列測定，提交GenBank，CDAl和CDA2的cDNA序列登錄號分別為DQ538514、DQ678929。再根據已知的cDNA序列設計基因特異性引物，以總狀毛霉全基因組DNA為模板，擴增得到了2個CDA基因的DNA片段，克隆并測序。CDA1和CDA2的DNA序列在Genbank的登錄號為EF468348、EF468

4、349。利用生物信息學的方法，對總狀毛霉的CDA1和CDA2的DNA及cDNA序列進行分析和酶蛋白構象預測，結果如下： (1)CDA1基因(cDNA)全長為1506 bp，包括下列三部分：5’非翻譯區(qū)(67 bp)；閱讀框(1344 bp)，共編碼448個氨基酸殘基； 3’非翻譯區(qū)(95bp)，其中包含加尾信號AATAAA及Poly(A)。在該基因的DNA分子內部(876～937bp)有一個內含子，長度為62bp，此內含子的5’

5、和3’剪接位點符合GU—AG規(guī)則。 而CDA2基因(cDNA)全長為1378 bp，分別為：5’非翻譯區(qū)(23 bp)；1254bp閱讀框，編碼418個氨基酸殘基；101bp 3’非翻譯區(qū)，其中包含了加尾信號AATAAA及Poly(A)。該基因的DNA分子中不含有內含子序列。 (2)通過同源性搜索(Blastp)可知：CDA1和CDA2的cDNA中間部分均包含一由144個氨基酸殘基組成的多糖脫乙酰酶保守結構域，約占總狀毛

6、霉CDA全長的30％。該保守結構域不僅存在于毛霉屬(Mucoraceae)微生物的CDA中，而且在其他真菌(如Saccharomyces cerevisiae)中存在，甚至在一些細菌(如Bacillus subtilis)的多糖脫乙(3)CDA1基因與其它相近種米根霉(Rhizopus oryzae)、卷柄根霉(Rhizopus circinans)的CDA1和CDA2、魯氏毛霉(Mucor rouxii)、卵形孢球托霉(Gongron

7、ella butleri)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、布拉克須霉(Phycomyces blakesleeanus)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的CDA1和CDA2基因的序列同源性分別為：75％、58％、56％、56％、48％、39％、39％、17％和16％；相應的氨基酸序列的同源性分別為：69％、57％、59％、55％、47％、30％、32％、18％和21％。CDA2基因與該霉

8、的CDA1基因、其它相近種米根霉、卷柄根霉的CDA1和CDA2、魯氏毛霉、卵形孢球托霉、匍枝根霉、布拉克須霉、釀酒酵母的CDA1和CDA2基因的序列同源性分別為：55％、51％、55％、53％、68％、43％、35％、15％、 14％和H13％；相應的氨基酸序列的同源性分別為：52％、52％、54％、49％、66％、47％、33％、32％、23％和24％。所以，真菌的CDA基因在進化上并不保守。 (4)根據CDA基因推測所得氨基

9、酸序列構建的不同真菌的系統(tǒng)樹，與采用經典分類法構建的系統(tǒng)樹基本一致。 (5)通過同源建模方法，預測了CDA1和CDA2基因所編碼的蛋白質的三級結構，驗證了蛋白質具有CDA完整的功能性結構，并包含多糖脫乙酰酶結構域，兩者具有相似的空間結構。 (6)信號肽預測分析表明：CDA1和CDA2推測蛋白質的N-末端均存在信號肽，信號肽長度分別為22和24個氨基酸殘基。 第三部分的主要內容為將總狀毛霉CDA1和CDA2基因進行

10、原核表達，并對重組蛋白純化、分析。 運用基因重組的方法手段，將CDA1和CDA2基因構建進入原核表達質粒pET28a、pET22b、pET32a及pET43.1a，經過PCR鑒定、雙酶切鑒定以及表達區(qū)域全部或部分序列測定，結果證實：已正確構建了pET28a-CDA1、pET28a-CDA2、pET32a-CDA1、pET32a-CDA2、pET43.1a-CDA1、pET43.1a-CDA2、pET22b-CDA1及pET22b

11、-CDA2共8個重組質粒。其中pET28a-CDA1、pET28a-CDA2的全序列測定表明：重組區(qū)域的CDA1基因(共1278bp)有4個堿基發(fā)生突變，兩個造成了氨基酸突變；而重組質粒的CDA2基因(共1182bp)中也有2處堿基發(fā)生突變，其中之一的氨基酸序列也發(fā)生了突變，兩基因片段突變率均小于0.5％；在其余6個重組質粒的表達基因接入區(qū)域，部分序列測定的結果顯示：CDA1和CDA2的基因(無內含子)均已去除信號肽，并正確的接入了表達

12、區(qū)域，未產生移碼突變。 將8個重組質粒轉化進入宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)，采用37℃、終濃度為0.5～lmmol/L的IPTG誘導重組蛋白表達。結果表明：重組質粒在宿主細胞內都成功地表達產生了蛋白質，所得的重組蛋白或融合蛋白的分子量與預計的理論值相符。重組質粒pET28a-CDA1、pET28a-CDA2、pET22b-CDA1及pET22b-CDA2表達的重組蛋白以包含體為主；而pET32a-CDA1、pET32a-CD

13、A2、pET43.1a-CDA1及pET43.1a-CDA2表達的融合蛋白仍以包含體為主，但已能電泳檢測到一定比例的司溶表達部分。利用親和層析可以分離、純化重組質粒pET28a-CDA1、DET28a-CDA2表達的包含體蛋白質。從誘導后表達的細胞中離心分離出包含體形式的重組蛋白，用6M鹽酸胍變性溶解后，專一性的結合在HisTrap(Ni<'2+>-Sepharose)親和柱，用6-0M脲線性梯度、使變性的重組蛋白在柱上重折疊，最后改變