重組hBMP-2在CHO細胞中的表達、鑒定及活性分析.pdf

1、195828玎南開人學生命科學學院碩士學位論文南開大學學位論文版權使用授權書本人完全了解南開大學關于收集、保存、使用學位論文的規(guī)定，同意如下各項內(nèi)容：按照學校要求提交學位論文的印刷本和電子版本；學校有權保存學位論文的印刷本和電子版，并采用影印、縮印、掃描、數(shù)字化或其它手段保存論文；學校有權提供目錄檢索以及提供本學位論文全文或者部分的閱覽服務；學校有權按有關規(guī)定向國家有關部門或者機構送交論文的復印件和電子版；在不以贏利為目的的前提下，學校

2、可以適當復制論文的部分或全部內(nèi)容用于學術活動。學位論文作者簽名：侈遭豐∥口‘年pr月研日經(jīng)指導教師同意，本學位論文屬于保密，在r年解密后適用本授權書。指導教師簽名：E∑)娣學位論文作者簽名：滲眸么二天分解密時間：≯口，f年I二月’歲1日各密級的最長保密年限及書寫格式規(guī)定如下：內(nèi)部5年(最長5年，可少于5年)秘密★lO年(最長10年，可少于10年)機密★20年(最長20年，可少于20年)中文摘要重組hBMP2在CHO細胞中的表達、鑒定及活

3、性分析中文摘要BMPs(Bonemorphogenticprote。in，BMP)屬于轉化生長因子(Transformationgrowthfactor，TGF)B超家族，BMPs最早是從骨中提取得到，能夠在體內(nèi)誘導異位骨和軟骨形成，迄今為止，已經(jīng)有40多個BMPs基因相繼被克隆。許多BMPs的體外(invitro)和體內(nèi)(invivo)實驗表明BMPs具有調(diào)節(jié)成骨細胞和成軟骨細胞的分化，誘導異位骨形成，促進骨折愈合，及具有控制哺乳動物

4、骨骼不同形態(tài)特征形成的功能。BMP2是BMP家族中的重要一員，其高效的誘導成骨活性已經(jīng)在臨床前以及臨床實驗中得到證實，顯示了在治療難愈性骨折治療，骨質疏松癥的預防，脊柱融合術，牙齒工程等眾多臨床應用中的巨大潛力。本研究采用基因工程的方法，在體外表達重組入骨形態(tài)發(fā)生蛋白2。研究中，我們采用RTPCR、cDNA克隆、真核表達載體構建、細胞轉染，穩(wěn)定表達細胞系的克隆、WesternBlot等生物學技術與方法，在哺乳動物細胞中表達rhBMP2蛋

5、白，篩選穩(wěn)定、高效表達rhBMP2的重組CHO細胞系?，F(xiàn)將已完成的工作報告如下：1rhBMP2真核表達載體的構建以本實驗室已構建的含有hBMP2cDNA全長序列(GenBankaccessionNoNM001200)的質粒pCDNA6AhBMP2為模板，通過PCR反應擴增得到hBMP2的cDNA全長序列，并將其連接至表達載體質粒pCDNA31()中，構建了hBMP一2的真核表達質粒pCDNA31()hBMP2，用其轉化感受態(tài)細胞叵col

6、iDH5Q，采用菌落PCR的方法篩選陽性菌落，并進一步提取質粒DNA進行酶切鑒定，鑒定結果與預期吻合，測序結果表明讀碼框完全J下確。2構建穩(wěn)定、高效表達rhBMP2的CHO細胞系將真核表達載體pCDNA31()hBMP2與篩選標記載體pSV2dhfr以l：5(摩爾比)混合，利用脂質體法共轉染CHO(dhfr)細胞。G418及dhfr雙抗性篩選3周后，獲得穩(wěn)定轉染hBMP2和空載的細胞系，利用MTX擴增系統(tǒng)大量擴增hBMP2基因在宿主染色